大鼠彌漫性軸索損傷神經(jīng)元、軸索繼發(fā)性改變的實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)亦稱彌漫性白質(zhì)損傷，是頭部在機(jī)械性外力作用時(shí)，在剪應(yīng)力的作用下引起的以白質(zhì)的廣泛變性為主要特征的一種腦損傷。DAI可單獨(dú)發(fā)生，也可伴發(fā)各種顱腦損傷，是顱腦損傷中最常見(jiàn)的致命性損傷。DAI是顱腦損傷后出現(xiàn)無(wú)血腫性持續(xù)昏迷、嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙和植物生存的最常見(jiàn)原因，致殘率和致死率高，是法醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)課題之一。 大部分DAI的肉眼改變極其微小，很難通過(guò)死后

2、尸檢的肉眼改變進(jìn)行診斷，只能通過(guò)微觀的形態(tài)學(xué)驗(yàn)證。彌漫性腦白質(zhì)尤其是在胼胝體和腦干部位的神經(jīng)纖維的形態(tài)學(xué)改變是診斷DAI的主要病理學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)參照1994年Marmarou A等的方法建立大鼠彌漫性軸索損傷模型，并觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元胞體和軸索發(fā)生的繼發(fā)性病理改變，進(jìn)一步探討彌漫性軸索損傷的病理機(jī)制，以期為法醫(yī)病理學(xué)和法醫(yī)臨床學(xué)鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：Sprague-Dawley大鼠(體重：383±26克)隨機(jī)分為12

3、組：正常對(duì)照組、手術(shù)對(duì)照組、損傷組；損傷組包括打擊后不同時(shí)相組：0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d。參照Marmarous A等的方法制備大鼠腦彌漫性軸索損傷模型：稱重后水合氯醛麻醉大鼠，達(dá)到一定麻醉深度后沿頂部正中線切開(kāi)頭皮，分離皮下組織、骨膜，暴露冠狀縫和人字縫之間顱骨，將一直徑為10mm、厚3mm的不銹鋼墊片固定于顱骨項(xiàng)部冠狀縫和人字縫中間位置，縫合多余手術(shù)切口。次日，乙醚麻醉大鼠，將其俯臥固定于致

4、傷裝置的樹(shù)脂盒內(nèi)的海綿床上(12×12×43cm)，保證大鼠頭部位置端正，并使墊片的中央正對(duì)致傷裝置有機(jī)玻璃管的下口。重錘(銅質(zhì)，450g)從指定的高處(2m)自由下落至圓盤形的墊片上，海綿床連同大鼠要在打擊后迅速撤離有機(jī)玻璃管下方防止二次打擊。隨后將大鼠轉(zhuǎn)移至操作臺(tái)上檢查疼痛反射及有無(wú)顱骨骨折。正常對(duì)照組大鼠不作任何處理；手術(shù)對(duì)照組大鼠給予手術(shù)及打擊前處理，但不予打擊；損傷組按上述方法給予打擊，根據(jù)打擊后不同時(shí)間處死。大鼠麻醉后全身灌

5、注固定取全腦，制作石蠟切片，采甩HE染色、硫瑾染色、Gless r嗜銀染色和免疫組織化學(xué)的方法觀察損傷的神經(jīng)元胞體和軸索形態(tài)學(xué)改變，并用TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元的DNA損傷情況。 數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean士SD)表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，以p＜0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 1損傷組大鼠打擊后即刻出現(xiàn)昏迷和呼

6、吸暫停(≤20s)，平均昏迷時(shí)間為6.90±2.48min。根據(jù)大鼠行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)損傷組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)均伴有不同程度的下降，平均分?jǐn)?shù)為6.5±2.05。 2手術(shù)對(duì)照組和正常對(duì)照組相比無(wú)明顯改變；損傷后早期海馬、皮層和腦干等部位神經(jīng)元腫脹，體積增大，核膜不清，核仁深染偏位或消失，并可見(jiàn)到深染的粉紅色固縮神經(jīng)元。24h粉紅色固縮神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，神經(jīng)細(xì)胞周圍出現(xiàn)空隙，核固縮，胞質(zhì)和胞核黏附(稱為暗細(xì)胞)，7d組仍可見(jiàn)少量暗細(xì)胞存在。

7、 3 硫瑾染色結(jié)果：神經(jīng)元尼氏小體從核周開(kāi)始崩解呈塵狀顆粒，并逐漸向外擴(kuò)展，進(jìn)而完全溶解消失。損傷后3h大腦皮層和海馬開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞的增多，至傷后48h達(dá)到高峰，傷后7d陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)仍高于正常對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組(p＜0.05)。 4 GLESS氏嗜銀染色結(jié)果：正常對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)纖維排列整齊，表面光滑。損傷組腦組織早期無(wú)明顯改變，打擊后12h胼胝體和腦干部位神經(jīng)軸索呈現(xiàn)扭曲、腫脹、波浪狀改變和軸索收縮球形成

8、，24h及48h變化更加明顯，72h以后受損軸索數(shù)目減少，呈恢復(fù)期改變。 5 β-APP的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：正常對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組軸索無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。損傷組于打擊后1h可見(jiàn)軸索β-APP陽(yáng)性表達(dá)增高，胼胝體和腦干部位出現(xiàn)大量呈腫脹、波浪狀改變的軸索以及軸索收縮球。24h及48h的β-APP表達(dá)量達(dá)到峰值，受損軸索直徑增大，72h以后受損軸索數(shù)目減少，7d組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)。 6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞

9、凋亡結(jié)果：正常對(duì)照組、手術(shù)對(duì)照組以及損傷后0h、1h、3h組僅發(fā)現(xiàn)個(gè)別染色陽(yáng)性細(xì)胞，損傷后6h染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始增多，海馬凋亡細(xì)胞數(shù)在損傷后24h到達(dá)高峰，大腦皮層48h凋亡達(dá)到高峰，損傷后7d大腦皮層仍有大量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，與對(duì)照組相比有顯著性差異(p＜0.05)。 結(jié)論： 1本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠DAI模型，制作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，結(jié)果可靠，可用于DAI的基礎(chǔ)研究。 2.DAI是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，隨著時(shí)間的推移，呈現(xiàn)