植物活性成分與DNA體外相互作用檢測(cè)技術(shù)及分子機(jī)制的研究.pdf

1、來(lái)源于植物界的活性成分如黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、皂苷類(lèi)、生物堿類(lèi)、多糖類(lèi)、酚酸類(lèi)等具有多種藥理活性。DNA是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是絕大多數(shù)具有抗癌、抗病毒等活性的藥物在生物體內(nèi)的標(biāo)靶，藥物分子通過(guò)與DNA的結(jié)合，可以干擾DNA的復(fù)制從而使腫瘤及病毒細(xì)胞遭受破壞。
　　本論文通過(guò)構(gòu)建多種光譜學(xué)技術(shù)包括紫外–可見(jiàn)吸收光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法(CD)以及紅外光譜法(FT?IR)等與化學(xué)計(jì)量學(xué)和分子模擬結(jié)合的方法體系，在模擬人體生理酸度(

2、pH7.4)的條件下，研究了補(bǔ)骨脂素等幾種植物活性成分與小牛胸腺DNA(ctDNA)相互作用的結(jié)合特性與分子機(jī)制，該研究為藥物小分子與DNA的相互作用檢測(cè)提供了新的研究思路和技術(shù)平臺(tái)，同時(shí)也為從分子水平上認(rèn)識(shí)藥物分子與DNA的作用機(jī)制、藥理活性及進(jìn)行藥物的體外篩選提供理論基礎(chǔ)。
　　本文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.概述了DNA的結(jié)構(gòu)及生理特性，綜述了小分子與DNA相互作用研究方法及現(xiàn)狀。
　　2.構(gòu)建基于化學(xué)計(jì)

3、量學(xué)多元曲線(xiàn)分辨–交替最小二乘法(MCR–ALS)與紫外、熒光、CD和FT?IR等光譜學(xué)技術(shù)以及分子模擬結(jié)合的方法體系，測(cè)定了呋喃香豆素類(lèi)化合物補(bǔ)骨脂素(PSO)、8?甲氧基補(bǔ)骨脂素(8–MOP)與ctDNA的的結(jié)合性質(zhì)，并研究了其相互作用分子機(jī)制。分別將不同滴定模式下獲得的PSO或8–MOP與ctDNA作用的多個(gè)復(fù)雜紫外光譜數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行組合，構(gòu)建了一個(gè)信息量更豐富的擴(kuò)展數(shù)據(jù)矩陣，利用MCR–ALS分別解析了PSO、8–MOP與ctDN

4、A相互作用的擴(kuò)展紫外光譜數(shù)據(jù)矩陣，從嚴(yán)重重疊的光譜信息中獲得了目標(biāo)組分(PSO、ctDNA和PSO–ctDNA或8–MOP、ctDNA和8–MOP–ctDNA)的純光譜和濃度變化趨勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了PSO、8–MOP與ctDNA相互作用進(jìn)程的定量檢測(cè)。探索了PSO或8–MOP與ctDNA之間的結(jié)合模式，發(fā)現(xiàn)PSO、8–MOP的存在都會(huì)引起KI猝滅效應(yīng)的減弱、ctDNA熔點(diǎn)和粘度的升高，由此確定這兩種藥物均以嵌插方式作用于ctDNA的堿基。FT–

5、IR光譜分析結(jié)果顯示，PSO優(yōu)先結(jié)合于ctDNA的A堿基上，而8–MOP主要與ctDNA上的A、T堿基作用。CD光譜分析發(fā)現(xiàn)PSO、8–MOP會(huì)對(duì)ctDNA的堿基堆積和雙螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生擾動(dòng)，但并不會(huì)改變DNA的B型構(gòu)象。分子模擬結(jié)果證實(shí)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果并直觀(guān)地展現(xiàn)了PSO、8–MOP與ctDNA的結(jié)合方式和空間結(jié)合姿態(tài)。
　　3.建立了紫外光譜法結(jié)合MCR–ALS法、三維熒光光譜法結(jié)合平行因子分析(PARAFAC)法的聯(lián)用技術(shù)，檢測(cè)了瑞香

6、素與ctDNA的相互作用及結(jié)合特性。通過(guò)MCR–ALS解析擴(kuò)展的紫外–可見(jiàn)吸收光譜數(shù)據(jù)矩陣，同時(shí)得到瑞香素與ctDNA反應(yīng)過(guò)程中3種主要組分(瑞香素，ctDNA，ctDNA–瑞香素復(fù)合物)的純光譜圖及其濃度變化曲線(xiàn)，定量監(jiān)控了ctDNA–瑞香素的相互作用形成復(fù)合物的過(guò)程。瑞香素對(duì)ctDNA的熔點(diǎn)、粘度以及KI的猝滅效應(yīng)影響不明顯，且單鏈DNA猝滅瑞香素?zé)晒獾哪芰Ρ入p鏈DNA強(qiáng)，表明瑞香素通過(guò)溝槽方式與ctDNA發(fā)生作用，PARAFAC分

7、解瑞香素與Hoechst33258競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ctDNA的三維同步熒光光譜，獲得的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了瑞香素的溝槽結(jié)合方式。分子模擬形象地展現(xiàn)出瑞香素與ctDNA小溝區(qū)的A、T堿基作用，這種預(yù)測(cè)與紅外光譜研究結(jié)果一致。CD光譜顯示，瑞香素誘導(dǎo)DNA的構(gòu)象由B型向A型轉(zhuǎn)變。
　　4.聯(lián)合應(yīng)用MCR–ALS、多種光譜技術(shù)、ctDNA熱變性試驗(yàn)、粘度測(cè)量以及DNA斷裂試驗(yàn)等測(cè)試手段，研究了瑞香素與金屬銅離子的配合作用，并檢測(cè)了瑞香素銅配合物與c

8、tDNA的作用特性。結(jié)果表明，瑞香素與銅的配合比為1:1。配合物的存在可增加DNA的粘度和熔點(diǎn)、與溴化乙錠(EB)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，表明配合物與ctDNA之間存在嵌插結(jié)合。二者的結(jié)合作用減少了ctDNA的螺旋性和堿基堆積，因此引起了ctDNA的圓二光譜變化。FT?IR分析顯示，配合物在ctDNA上的結(jié)合位點(diǎn)為A、T堿基，且不會(huì)引起DNA的構(gòu)象變化。此外，DNA斷裂實(shí)驗(yàn)表明，配合物與DNA的結(jié)合能力較強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA的斷裂。獲得的焓變和熵變結(jié)

9、果表明，瑞香素銅配合物與ctDNA的結(jié)合主要依靠氫鍵和疏水作用力驅(qū)動(dòng)。
　　5.在生理酸度條件下(pH7.4)，運(yùn)用熒光、CD、FT?IR光譜技術(shù)并結(jié)合粘度試驗(yàn)和熔點(diǎn)測(cè)量，研究了積雪草苷與小牛胸腺DNA之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA能明顯猝滅積雪草苷的熒光，猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅。積雪草苷與DNA之間的結(jié)合使DNA的熔點(diǎn)升高，粘度增大，說(shuō)明二者以嵌插方式結(jié)合，氫鍵和范德華力是結(jié)合反應(yīng)驅(qū)動(dòng)的主要作用力。CD和FT?IR光譜分析表明