LPS介導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路在膀胱癌T24細(xì)胞免疫逃逸過(guò)程中的作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、摘要目的：作為泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，膀胱癌在其發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)過(guò)程中逃避機(jī)體免疫監(jiān)督的諸多生物學(xué)行為正日益受到廣泛關(guān)注。研究表明Toll樣受體4(Toll—likereceptor4，TLR4)在多種惡性腫瘤中存在表達(dá)并與某些腫瘤的分期分級(jí)密切相關(guān)，提示TLR4可能參與了腫瘤的免疫逃逸過(guò)程；而共刺激因子B7H1可與T淋巴細(xì)胞表面的PD1結(jié)合并啟動(dòng)后者的凋亡過(guò)程，是免疫逃逸過(guò)程的重要分子。本研究的主要目的即探討LPS介導(dǎo)的TLR4信

2、號(hào)通路的活化與B7一Hl表達(dá)的關(guān)系，并探討他們參與膀胱癌免疫逃逸可能的分子機(jī)制。方法：1體外培養(yǎng)膀胱癌T24細(xì)胞系，分別以不同濃度的脂多糖(1ipop01ysaccharide，LPS)(0、025、05、075、10、2Oug／m1)刺激T24細(xì)胞8h，以激活TLR4信號(hào)通路。用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)T24細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)情況；分別提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetranscriptionpolymerasecha

3、inreaction，RTPCR)技術(shù)檢測(cè)共刺激因子B7HImRNA的表達(dá)情況；提取蛋白質(zhì)，用Western—blot蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)B7H1蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；2以濃度1ug／ml的LPS分別刺激T24細(xì)胞不同時(shí)間(Oh、2h、4h、6h、8h、12h)，以激活TLR4信號(hào)通路。用前述方法分別檢測(cè)檢測(cè)TLR4、B7H1mRNA、B7H1蛋白質(zhì)的表達(dá)情況：3以濃度為1ug／ml的LPS分別刺激T24細(xì)胞不同時(shí)間(Omin、15min、30

4、min、45min、60min、90min)，提取蛋白質(zhì)，用Western—blot技術(shù)檢測(cè)pERK、p—JNK、pP38蛋白的表達(dá)情況；4分別用ERK、JNK、P38的特異性抑制劑(O、10、20、40uM)處理T24細(xì)胞2h后，再加入lug／m1的LPS刺激20min，提取蛋白質(zhì)，用western—blot技術(shù)檢測(cè)pERK、p—JNK、pP38蛋白的表達(dá)情況；5分別加入ERK、JNK、P38的特異性抑制劑(0、10、20、40uM)

5、2h后，再加入1ug／m1的LPS刺激T24細(xì)胞8h后提取蛋白質(zhì)，用Western—blot技術(shù)檢測(cè)B7一H1蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；結(jié)果：iTLR4、BTH1mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均隨LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)或濃度提升而增加，并且在時(shí)間為8h、濃度為10ug／ml時(shí)達(dá)到高峰。且B7一H1mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)分別與T24細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)呈正相關(guān)；2LPS激活TLR4信號(hào)通路后，MAPK信號(hào)通路中的ERK、JNK、p38的磷酸化水平有不同程度的

6、提高；AbstractSubject：Asthemostprevalentmalignanttumorofurinarysystem，bladdercancerhaslongbeenlucubratedbyitsbiologicalbehaviorsintheimmuneevasionprocess，whichfacilitatesitsoccurrence，developmentandrecurrenceToll—likerecept

7、or4(TLR4)Wasfoundtobeaberrantlyexpressedincertaintumorcells，andwasstronglyrelated誠(chéng)ththeclinicalpathologicalparameters，suchasgradeandstage，suggestingtheimportantroleTLR4mayplayintheimmuneevasionprocessCostimulatorymolecul

8、eB7H1，aftercombinedtoPD一1expressedonthesurfaceofTcells，CantriggertheprogrammeddeathofTcells，whichisbelievedtocontributetotumorimmuneevasion，tooOurstudyWasaimedtodemonstratetherelationshipbetweenLPSinducedTLR4一signalingpa

9、thwayactivationandB7H1expression，andinvestigatethepromisingmolecularmechanismbetweenthemMethods：1T24bladdercancercell1ineswereculturedinvitroandthentreatedwithdifferentconcentrationoflipopolysaccharide(LPS)(O、025、05、075、

10、10、20p鰣【111)for8hourstoactivatetheTLR4signalingpathwayAndthenTLR4expressionWasexaminedbyflowcytometryanalysis，whileB7H1mRNAandproteinexpressionwereexaminedbyImPCRandWestern—Blotrespectively2T24cellsweretreated誦mLPS(1pg／m

11、1)forOh，2h，4h，6h，8h，12hrespectivelybeforeTLR4B7一H1mRNAandproteinWasexaminedbythemethodslistedearlier3T24cellsweretreatedwithLPS(1斗g／m1)forOmin，15min，30min，45min，60min，90minrespectivelyAndthenpERK，p一心KandpP38expressionwer

12、eexaminedbywestern—blotafterproteinextraction4T24cellswerestimulatedbyLPS(11xg／m1)for20minafterpretreated謝mthespecificinhibitorofERK，MandP38(0，10，20，40㈣，andthenpERK，pⅢKandpP38expressionwereexaminedbywestemblotafterprotei

13、nextraction5T24cellswerestimulatedbyLPS(1gg／m1)for8hoursafterpretreatedwimthespecificinhibitorofERK，ⅢKandP38(0，10，20，40pM)，andthenB7一H1proteinexpressionwereexaminedbywesternblotafterproteinextractionResults：1TLR4，B7H1mRN

14、AandproteinexpressionofT24cellsweresignificantly(pO05)upregulateddependingonthedurationandconcentrationofLPSstimulation，whichreachedpeakattheconcentrationof1p咖landstimulationtimeof8h—Furthermore，B7H1mRNAandproteinexpress