不同保存方法對(duì)純鈦表面理化性能以及生物活性的影響.pdf

1、背景:
　　 盡管人工種植牙應(yīng)用于臨床已將近半個(gè)世紀(jì)，并且被廣泛證實(shí)具有可靠的臨床效果，但是仍然存在著以下問題:(1)種植體植入體內(nèi)到臨床負(fù)重仍需要較長的愈合時(shí)間，最少需要6～12周的時(shí)間，這一定程度上限制了種植修復(fù)的臨床應(yīng)用;(2)種植體與骨的結(jié)合率仍然較低，只有50～65％，不利于種植體的長期穩(wěn)定。加快種植體-骨結(jié)合的速度不僅僅意味著修復(fù)時(shí)間的縮短，更重要的是使人工牙種植具有更高的安全性。研究表明，大部分的種植失敗發(fā)生于種植

2、體早期愈合的過程中，愈合時(shí)間越長，種植體受到各種風(fēng)險(xiǎn)因素的影響越大，種植失敗的風(fēng)險(xiǎn)越高。因此，更快更好的骨結(jié)合仍然是我們追求的目標(biāo)。
　　 大量的研究表明，種植體與骨組織形成結(jié)合的速度和強(qiáng)度與種植體表面的生物活性密切相關(guān)，而生物活性又與種植體表面的理化性能緊密相連。生物活性（bioactivity）是植入材料能夠與生物組織形成鍵合(Bone-bonding)的特性。即無論表面是否光滑，生物活性材料也能與生物組織產(chǎn)生直接的化學(xué)鍵性

3、結(jié)合。
　　 由于鈦及鈦合金的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與骨組織差異很大，加之表面鈍態(tài)氧化膜的存在。通常不能像生物活性材料那樣與骨組織發(fā)生化學(xué)鍵性結(jié)合。因此，一般認(rèn)為鈦金屬為生物惰性材料，并努力尋求各種方法進(jìn)行表面活化改性。鈦的生物活化是指使鈦金屬經(jīng)過表面處理后，能夠在生理環(huán)境誘導(dǎo)下，使羥基磷灰石層在其表面形成，與骨組織實(shí)現(xiàn)直接的化學(xué)鍵結(jié)合。增加鈦表面的生物活性有以下兩種思路:(1)通過表面加成法在鈦表面涂覆生物活性涂層（如羥基磷灰石、鈣磷酸鹽

4、、生物大分子等）;(2)通過表面改性使原鈍化態(tài)氧化膜轉(zhuǎn)化為活化態(tài)氧化膜或其他活性膜（如鈦酸鹽，Ca+Ti，TiO2+Ca+P膜等）。目前，常用的一些表面處理技術(shù)包括噴砂酸蝕，微弧氧化，羥基磷灰石涂層等等。與光滑種植體表面相比，這些表面處理技術(shù)明顯改善了種植體的表面活性，促進(jìn)了種植體-骨的結(jié)合。其中，紫外線光催化技術(shù)是近幾年的研究熱點(diǎn)之一。1997年，Wang等首先發(fā)現(xiàn)了紫外線照射TiO2膜上可以獲得高親水性表面的現(xiàn)象，并在Nature上

5、發(fā)表。此后，大量的學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了深入的研究。
　　 本課題組通過紫外線光催化技術(shù)處理純鈦表面，成功獲得了具有高表面能及高生物活性的表面，促進(jìn)了蛋白質(zhì)吸附、成骨細(xì)胞的黏附、增殖、分化和礦化。但進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，通過紫外線光催化技術(shù)獲得的高表面能及高生物活性效應(yīng)具有一定的時(shí)效性。經(jīng)過一段時(shí)間的保存后，這種效應(yīng)逐漸消失，鈦片表面的生物活性明顯降低。另外，在經(jīng)過其他表面處理方式制備的鈦表面上，也出現(xiàn)了鈦表面生物活性隨著保存時(shí)間的增加

6、而下降的情況，即鈦表面生物活性的老化現(xiàn)象(time-dependent degradation))。由此可見，鈦表面生物活性的老化是鈦基種植體普遍存在的現(xiàn)象。
　　 目前，導(dǎo)致鈦表面理化性能和生物活性隨時(shí)間下降的原因尚未明確。有研究認(rèn)為，這可能與鈦表面在儲(chǔ)存的過程中受到空氣中碳?xì)浠衔锏奈廴?，?dǎo)致表面元素構(gòu)成的改變及表面能下降有關(guān)。由于常規(guī)的種植體保存方式為常溫常壓保存于密封瓶里，可能會(huì)受到碳?xì)浠衔锏奈廴?，因此，在?chǔ)存的過程中

7、鈦表面理化性能及生物活性可能已經(jīng)發(fā)生變化，這值得我們深入研究。
　　 由于在實(shí)際應(yīng)用中，臨床醫(yī)生不可能獲得新制備的鈦種植體，應(yīng)用到臨床上的種植體均經(jīng)過或長或短的保存時(shí)間，可能出現(xiàn)了不同程度的生物活性的下降，因此，如何保持種植體的表面活性已成為一個(gè)重要的研究課題。本研究首先從保存方法的角度出發(fā)，研究不同保存方法對(duì)鈦表面的理化性能及生物活性的影響，以盡可能保持鈦表面的生物活性，使應(yīng)用到臨床上的種植體具有更佳骨結(jié)合效能。
　　

8、 目的:
　　 1.探討常規(guī)保存方法下，純鈦表面理化性能的時(shí)間性變化以及對(duì)生物活性影響。
　　 2.探討不同保存方法對(duì)純鈦表面理化性能及生物活性的影響，以及探討其可能的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.鈦片的制備及分組將商用二級(jí)純鈦(TA2)切割成直徑15mm，厚度1.5mm的鈦片后，通過H2SO4(49％)/HCl(18％)酸蝕法制備出具有一定的粗糙度，表面形態(tài)較為均勻，可重復(fù)性較高，表面清潔度良好的鈦表

9、面用于本實(shí)驗(yàn)。
　　 第一部分實(shí)驗(yàn):探討常溫常壓保存方法下，純鈦表面理化性能的時(shí)間相關(guān)性變化及對(duì)表面活性的影響。分組:組1:新制備鈦片;組2:避光保存于密封盒內(nèi)3天;組3:避光保存于密封盒內(nèi)2周;組4:避光保存于密封盒內(nèi)4周。制備完成的鈦片用于表面理化性能檢測、蛋白質(zhì)吸附及細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分實(shí)驗(yàn):探討不同保存方法對(duì)純鈦表面理化性能及生物活性的影響。分組:組1:新制備鈦片，即制備完成后即刻用于表面理化性能檢測和

10、細(xì)胞培養(yǎng)。組2:避光保存于密閉盒里。組3～5:制備完成后即刻保存于雙蒸水(ddH2O)/氯化鈉(NaCl)/氯化鈣(CaCl2)溶液中。組2～5中的鈦片根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，保存了3天，2周，4周不同時(shí)間，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)鈦片表面進(jìn)行理化性能檢測、蛋白質(zhì)吸附及細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
　　 以上實(shí)驗(yàn)均在清潔環(huán)境中完成。
　　 2.鈦片表面理化性能的檢測:
　　 通過掃描電鏡觀察、表面輪廓測量儀、X射線光電子能譜分析儀、水接觸角分

11、析儀等手段對(duì)不同處理組的鈦片表面進(jìn)行表面形貌、表面粗糙度、表面元素、表面親水性進(jìn)行檢測。以評(píng)估不同組別鈦片表面理化性能的差異。
　　 3.蛋白吸附實(shí)驗(yàn)使用牛血清白蛋白(BSA)作為模型蛋白，用于蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)。BCA法在波長為562 nm下測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)吸附率（百分比）。
　　 4.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)選取MG63成骨細(xì)胞系用于本實(shí)驗(yàn)，接種密度為2.4×104個(gè)/cm2。在不同的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，通過熒光染色劑染色

12、，熒光顯微鏡觀察，MTS試劑盒、ALP試劑盒、茜素紅染色等方法對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖、分化以及礦化情況進(jìn)行分析，以評(píng)估不同組別鈦片表面的細(xì)胞生物活性。
　　 統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用Spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組間樣品的表面理化性能、蛋白質(zhì)吸附、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和分化方面各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測定結(jié)果以(x)±s來表示，用析因設(shè)計(jì)分析處理組與不同時(shí)段是否存在交互效應(yīng)，如存在交互效應(yīng)，組間進(jìn)一步采用單因素方差分析(one-wa

13、y ANOVA)，然后采用Levene's test檢查方差齊性，方差齊時(shí)對(duì)樣本均數(shù)進(jìn)行兩兩比較的LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，采用近似F檢驗(yàn)的Welch方法進(jìn)行方差分析后，Dunnett'T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，假設(shè)檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)P＜0.01時(shí)，認(rèn)為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.掃描電鏡觀察結(jié)果:各組的鈦片均具有典型的酸蝕處理后的表面形態(tài)

14、，呈較均勻的多孔狀結(jié)構(gòu)，孔徑為1～3μm。表面輪廓儀分析證實(shí)，所有的表面具有相似的粗糙度，各項(xiàng)參數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。保存方式和保存時(shí)間對(duì)鈦片的表面形態(tài)沒有明顯的影響。
　　 2.X射線光電子能譜分析獲得的新制備的鈦片以及在其余4種不同方法中保存了3天，2周，4周不同時(shí)間的鈦片表面的高分辨能譜圖提示，所有樣品的表面均可發(fā)現(xiàn)Ti、O、C和微量的N，但不同組別的元素比例差異較大。新鈦片表面的碳元素含量最低，為26.0％。保存了3天后，在

15、常溫常壓、ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液下保存的鈦表面C元素含量分別為36.3％、26.4％、26.7％、26.2％;保存了2周后，鈦表面C元素含量分別為42.9％、29.8％、28.8％、28.2％;保存了4周后，鈦表面C元素含量分別為48.2％、31.3％、30.7％、30.1％。不同組別間的Ti和O元素比例也體現(xiàn)出不同的變化。由此可見，在相同的保存時(shí)間點(diǎn)，保存在ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中的鈦片表面碳元素顯

16、著低于常溫常壓下保存。但是需要注意的是，所有的保存方法都不能完全避免C元素的污染。
　　 3.1μL ddH2O在各組不同鈦片表面的靜態(tài)水接觸角表明，新制備的鈦片表面表現(xiàn)出超親水性的特性，當(dāng)ddH2O接觸到鈦片表面時(shí)，便迅速向四周鋪展，接近潤濕整個(gè)鈦片表面，靜態(tài)水接觸角為0°。當(dāng)將鈦片常溫常壓下保存時(shí)，隨著保存時(shí)間的延長，鈦表面由親水性迅速向疏水性轉(zhuǎn)變。在保存3天后，靜態(tài)水接觸角為變?yōu)?9.70°;2周后，增加至90.27°;4

17、周后，變?yōu)?14.53°。而保存在ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中的鈦片表面，在保存3天及2周后，靜態(tài)水接觸角仍然為0°，即便在第4周時(shí)，仍保持了超級(jí)親水性（接觸角＜5°）的特性。
　　 2μL ddH2O在鈦片上的接觸面積表明，在常溫常壓保存方式下，ddH2O在鈦片上的接觸面積也隨著保存時(shí)間的延長而劇烈減少。但是要注意的是，在這三種保存方式下，ddH2O在鈦片表面的潤濕面積也隨著保存時(shí)間的延長而逐漸減小，但仍明顯優(yōu)于

18、常溫常壓下保存的鈦片表面。
　　 4.不同處理組鈦片表面1h的蛋白質(zhì)吸附率結(jié)果提示:在常溫常壓保存方式下，鈦片表面蛋白質(zhì)吸附能力隨著保存時(shí)間延長下降的程度比保存在ddH2O、NaCl溶液中的鈦片表面明顯，而保存在CaCl2溶液中的鈦片表面蛋白質(zhì)吸附能力保持了穩(wěn)定性，未隨著保存時(shí)間的延長而明顯下降，在3天、2周及4周的保存時(shí)間里，保存在CaCl2溶液中的鈦片表面均表現(xiàn)出了最高的蛋白質(zhì)吸附能力，在保存了3天鈦片表面，蛋白質(zhì)吸附能力甚

19、至略高于新鈦片組。
　　 5.在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中所選擇的30min、1h、2h及4h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，所有處理組的鈦片表面的細(xì)胞黏附量均隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加。新制備的鈦片表面的細(xì)胞黏附效果非常好，細(xì)胞接種30 min后，約有40％的細(xì)胞成功黏附，而在接種4h后，大部分的細(xì)胞已經(jīng)黏附到鈦片表面。在常溫常壓下保存了3天，2周及4周的鈦片表面，同一細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞黏附率隨著保存時(shí)間的增加而顯著減少。在常溫常壓下保存了4周的鈦片表面，

20、細(xì)胞接種30min后，黏附率僅為新制備鈦表面的5％，即便經(jīng)過4h的培養(yǎng)，也僅有50％接種細(xì)胞黏附到鈦片表面。通過比較保存在常溫常壓密封盒內(nèi)、ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中4周的鈦片表面在30 min、1h、2h及4h細(xì)胞黏附情況，可以發(fā)現(xiàn)，保存在常溫常壓密封盒內(nèi)細(xì)胞的黏附效果最差，顯著低于其它三種保存方法。所有的保存方法中，在CaCl2溶液中保存的鈦片表面在4個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出最好的細(xì)胞黏附率，與新制備的鈦片表面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

21、異。
　　 6.細(xì)胞接種4h后，在熒光顯微鏡下觀察不同處理組鈦片表面細(xì)胞骨架的形態(tài)，可見新制備的鈦片表面大部分細(xì)胞伸展良好，細(xì)胞呈扁平狀，胞漿豐富，大量的偽足向四周伸出。在常溫常壓下保存了3天的鈦片表面上，僅見少部分伸展良好的細(xì)胞，其余大部分細(xì)胞胞體較小，呈圓形或橢圓形，未充分展開，在保存了2周和4周的鈦片表面上，幾乎所有的細(xì)胞胞體都呈圓形或橢圓形，未充分展開。在保存于ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中4周的鈦片表面，細(xì)

22、胞形態(tài)與新制備鈦片表面上的細(xì)胞相近，大部分細(xì)胞伸展良好。
　　 7.在細(xì)胞培養(yǎng)第1天和第3天，在常溫常壓下保存了3天，2周及4周的鈦片表面，細(xì)胞的增殖活性均隨著保存時(shí)間的增加而減少。通過比較保存在常溫常壓密封盒內(nèi)、ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中4周的鈦片表面的細(xì)胞增殖活性，可以得知，在細(xì)胞培養(yǎng)的第1天時(shí)，保存在ddH2O、NaCl溶液和CaCl2溶液中的鈦片表面細(xì)胞增殖活性與新制備的鈦片表面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且顯著高

23、于常溫常壓保存的鈦片表面。在細(xì)胞培養(yǎng)的第3天時(shí)，保存在ddH2O、NaCl溶液和CaCl2溶液中的鈦片表面細(xì)胞增殖活性依然高于常溫常壓下保存的鈦片表面。其中，CaCl2組保存的鈦片表面細(xì)胞增殖活性最好，顯著高于保存在ddH2O及NaCl溶液中的鈦片表面(p＜0.05)，但與新制備的鈦片表面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 8.堿性磷酸酶是細(xì)胞分化的早期標(biāo)志。在細(xì)胞培養(yǎng)的第7天，對(duì)各組細(xì)胞培養(yǎng)樣本進(jìn)行堿性磷酸酶活性的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞

24、的堿性磷酸酶活性沒有顯著的差異。鈦片的保存方法不會(huì)顯著影響細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。
　　 細(xì)胞外基質(zhì)礦化是通過茜素紅染色來檢測。實(shí)驗(yàn)證明，鈦片表面細(xì)胞礦化能力受到保存方法的影響。常溫常壓保存的鈦片表面細(xì)胞外基質(zhì)礦化能力最低，顯著低于其他組，而保存于CaCl2溶液中的鈦片表面以及新制備的鈦片表面的礦化能力最強(qiáng)。顯著高于其它組。
　　 結(jié)論:
　　 1.空氣中碳?xì)浠衔锏奈廴撅@著影響純鈦表面的理化性能和生物學(xué)性能。