苦參堿聯(lián)合T淋巴細(xì)胞對(duì)人胃癌細(xì)胞株NCI-N87作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1).探討不同濃度苦參堿對(duì)人胃癌細(xì)胞株NCI-N87體外增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡作用及bcl-2蛋白表達(dá)的影響;(2).檢測(cè)苦參堿對(duì)體外人外周血T淋巴細(xì)胞增殖的影響,探討苦參堿對(duì)T淋巴細(xì)胞的可能影響情況,以及苦參堿聯(lián)合T淋巴細(xì)胞殺傷胃癌的作用,為臨床應(yīng)用苦參堿治療胃癌提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù). 方法： 實(shí)驗(yàn)Ⅰ.苦參堿對(duì)人胃癌細(xì)胞株NCI-N87增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和bcl-2蛋白表達(dá)的影響: 1.用不同濃度

2、(0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、6.0mg/ml)的苦參堿分別作用于胃癌細(xì)胞株NCI-N87 24、48、72h,采用CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變; 2.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度(0.5、1.0、2.0mg/ml)苦參堿對(duì)NCI-N87細(xì)胞凋亡率的影響、細(xì)胞周期的變化及bcl-2蛋白表達(dá)的影響: 實(shí)驗(yàn)Ⅱ.苦參堿對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖的影響及聯(lián)合T淋巴細(xì)胞抗腫瘤作

3、用的實(shí)驗(yàn)研究: 1.從人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞,加細(xì)胞因子PHA-L、IL-2、OKT-3誘導(dǎo)其分化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群.利用CCK-8法檢測(cè)不同濃度苦參堿對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響程度. 2.用0.5、1.0 mg/ml苦參堿和T淋巴細(xì)胞(效靶比20:1)處理胃癌細(xì)胞NCI-N87 48和72小時(shí)后,利用臺(tái)盼蘭拒染法來評(píng)價(jià)兩者單用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,臺(tái)盼蘭拒染的為活細(xì)胞被計(jì)數(shù).用ELISA試劑盒測(cè)定培

4、養(yǎng)上清液中的IL-2、工FN-γ細(xì)胞因子水平. 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)Ⅰ:1.苦參堿濃度在0.1mg/ml,對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎無抑制作用;濃度>3mg/ml,細(xì)胞毒作用較大,出現(xiàn)大量懸浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片;濃度在0.5～2.0mg/ml時(shí),對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用(P<0.01),且呈時(shí)間劑量依賴性,光學(xué)顯微鏡下可見典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變.2.流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,苦參堿可以增加胃癌細(xì)胞株NCI-N87 G1期細(xì)胞所占的百分比,

5、阻止細(xì)胞進(jìn)入S期;細(xì)胞凋亡百分率隨藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,而bcl-2蛋白的表達(dá)則隨之下降. 實(shí)驗(yàn)Ⅱ:1.分離后的外周血單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)0KT-3、IL-2、PHA-L刺激后的T淋巴細(xì)胞比例為79.2﹪, 1.0、2.0和3.0mg/ml苦參堿對(duì)人T淋巴細(xì)胞增殖呈抑制作用,而0.1、0.5mg/ml苦參堿對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用. 2.0.5、1.Omg/ml苦參堿聯(lián)合T淋巴細(xì)胞與胃癌細(xì)胞株NCI-N87在

6、體外共同培養(yǎng)后,可見其顯著增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,腫瘤活細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01),0.5mg/ml苦參堿組培養(yǎng)上清液中IL-2和IFN-Y水平與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.01),1.0mg/ml苦參堿不能增加IL一2和IFN-Y的分泌. 結(jié)論： 1.一定濃度苦參堿對(duì)人胃癌細(xì)胞有明顯地抑制作用,并且抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性;苦參堿可能是通過將人胃癌細(xì)胞周期阻滯在S期,抑制其增殖.并通過下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)