兩種海水魚piscidin-like抗菌肽基因的克隆、序列分析及piscidins家族系統(tǒng)進(jìn)化研究.pdf

1、抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一類具有廣譜抗微生物活性的天然小肽類物質(zhì)，是先天免疫系統(tǒng)中重要的非特異性免疫因子。Piscidin一詞最初來源于Silphaduang等從雜交斑紋鱸(hybrid stripedbass，Morone.chrysops×M.saxatils)肥大細(xì)胞分離出的一種肽類抗菌素，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，從鲆鰈類獲得的抗菌肽pleurocidin，雜交斑紋鱸的moronecidin，歐洲

2、狼鱸(Dicentrarchus labrax)的ditentracin，斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)的epinecidin-1等，都具有和piscidin十分相似的氨基酸序列及其多肽結(jié)構(gòu)和功能，為α-螺旋、帶正電荷、兩性親和多肽，可以統(tǒng)稱為piscidin。本論文以我國重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類——赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelus akaara)和大黃魚(Pseudosciaena crocea)為研究對象，克隆

3、得到兩種魚類的piscidin類抗菌肽基因，并分析其氨基酸序列組成和次級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，與piscidin家族其他成員進(jìn)行多序列比對，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，研究結(jié)果如下： 1、通過RT-PCR、3'RACE、5'RACE和測序等分子生物學(xué)技術(shù)，從赤點(diǎn)石斑魚的頭腎和脾臟擴(kuò)增出piscidin-like抗菌肽序列，并進(jìn)行序列分析和蛋白特性預(yù)測，結(jié)果顯示赤點(diǎn)石斑魚piscidin為帶正電荷的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，成熟肽碳末端具有強(qiáng)陽離子四肽的RR

4、RH結(jié)構(gòu)，與斜帶石斑魚成熟肽碳末端一致，這種結(jié)構(gòu)有利于提高與細(xì)菌胞膜的結(jié)合能力，與piscidins家族其他抗菌肽序列相似性為59％-79％，一致性為45％-75％，其氨基酸序列和次級結(jié)構(gòu)符合piscidin抗菌肽家族的特征，表明從赤點(diǎn)石斑魚頭腎和脾組織克隆得到的piscidin-like抗菌肽基因是piscidin基因變體，屬于piscidins家族的新成員。 2、通過RT-PCR、3'RACE、5'RACE和測序等分子生物學(xué)

5、技術(shù)，從大黃魚的頭腎和脾臟擴(kuò)增出piscidin-like抗菌肽序列，并進(jìn)行序列分析和蛋白特性預(yù)測，結(jié)果顯示大黃魚piscidin成熟肽為帶正電荷的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，成熟肽碳末端沒有石斑魚類的RRRH結(jié)構(gòu)，正電荷值比赤點(diǎn)石斑魚piscidin低，優(yōu)勢域碳末端也沒有鱸魚類的XQQ模塊，與piscidins家族其他抗菌肽序列相似性50-77％，一致性41-70％，其氨基酸序列和次級結(jié)構(gòu)符合piscidin抗菌肽家族的特征，表明從大黃魚克隆

6、得到的piscidin-like抗菌肽基因是piscidin基因變體，屬乎piscidins家族的新成員。 3、利有CLUSTALW軟件對piscidin家族抗菌肽進(jìn)行多序列比對，驗(yàn)證了其具有高度序列同源性，說明生物體結(jié)構(gòu)與功能的高度統(tǒng)一。利用MEGA4.0軟件繪制了Piscidin抗菌肽家族與其它魚類抗菌肽家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹，驗(yàn)證了從赤點(diǎn)石斑魚和大黃魚克隆得到的基因?qū)儆隰~類piscidin抗菌肽基因，且piscidin家族抗菌肽