食物致敏性評價方法及胡桃蛋白Jugr1致敏性研究.pdf

1、目的： 1.研究BN大鼠作為動物致敏模型的可行性，并以此初步建立致敏動物模型和評價指標，為食品的致敏性評價提供手段和方法。 2.研究不同蛋白質(zhì)在體外模擬胃腸消化環(huán)境和熱加工處理環(huán)境中的穩(wěn)定性，以確定模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗和熱穩(wěn)定性試驗中的陽性和陰性參考蛋白質(zhì)，并以此建立體外蛋白消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性方法。 3.通過原核表達系統(tǒng)提取和純化足量的胡桃Jug r 1蛋白，為其致敏性評價做好準備。 4.通過體內(nèi)體

2、外實驗?zāi)Ｐ蛯ug r1蛋白的致敏性進行初步的研究。 方法： 1.B N大鼠致敏動物模型的實驗研究經(jīng)口致敏模型：將30只雌性BN大鼠隨機分成3組——OVA組、PAP組和陰性對照組，每組10只，分別灌胃給予1mg/ml的OVA、PAP和生理鹽水，每只每天1 ml，共進行42天。腹腔注射致敏模型：40只雌性BN大鼠隨機分成4組——OVA組、OVA+Al(OH)<,3>組、PAP組和陰性對照組，每組10只，第1天分別腹腔注射0

3、.1mg/ml的OVA、OVA+免疫佐劑Al(OH)<,3>、PAP和生理鹽水1ml，第5和10天重復(fù)兩次。 各組大鼠于第14、28、42天內(nèi)眥取血離心分離血清用以檢測特異性IgG和IgE抗體，第21、35天內(nèi)眥取血加入抗凝劑離心分離血漿以檢測組胺，以之觀察免疫系統(tǒng)效應(yīng)。各組大鼠42天試驗結(jié)束后隨機抽取5只大鼠予以大劑量(2ml5mg/ml)相應(yīng)物質(zhì)的刺激，監(jiān)測7小時內(nèi)血壓變化以觀察循環(huán)系統(tǒng)效應(yīng)。各組剩余的5只大鼠經(jīng)口予以2ml

4、 50mg/ml的相應(yīng)物質(zhì)的刺激，30分鐘后灌胃給予100mg/ml的β-LG 1ml，分別于0.5、1、2、4和8小時后內(nèi)眥取血，離心分離血清，檢測血清中的β-LG以觀察胃腸系統(tǒng)滲透性的改變。 2.體外模擬消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性模型研究按照美國藥典提供的模擬胃液、腸液配方，建立體外模擬胃腸消化體系，并模擬熱加工處理環(huán)境，選取常見食物致敏原蛋白(雞卵清蛋白、牛β-乳球蛋白)、不常見食物致敏原蛋白(牛血清白蛋白)和無致敏史食物蛋白(

5、大豆脂肪水解酶、馬鈴薯酸性磷酸酶)，研究這5種已知致敏性的標準蛋白的消化和熱穩(wěn)定性，選出該模型的陽性和陰性對照，用以評價其它蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。 3.胡桃蛋白Jug r1的原核表達與純化對已建立的工程菌進行質(zhì)粒測序確認構(gòu)建正確后，進行誘導(dǎo)表達最佳條件的探索。大量誘導(dǎo)表達Jug r 1蛋白包涵體，通過超聲破碎菌體分離并純化包涵體。將包涵體溶于6M鹽酸胍的包涵體溶解液中，并通過透析方法使其復(fù)性，得到Jugr1蛋白溶液。使用考馬斯亮蘭G2

6、50法測定蛋白含量，最后用低溫真空離心濃縮干燥機濃縮溶液。 4.Jug r1的致敏性研究體內(nèi)試驗：選用腹腔注射致敏模型，30只雌性BN大鼠隨機分成3組：OVA組、Jug r 1組和PAP組。第1天經(jīng)腹腔注射途徑給予1ml 0.1mg/ml相應(yīng)的蛋白溶液，第5和10天重復(fù)兩次。第14、28、42天取血清檢測特異性IgE抗體，第21、35天取血漿檢測組胺含量。第42天后監(jiān)測血壓和進行腸滲透性檢測。 體外試驗：對Jug r1進

7、行模擬胃液消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性試驗，設(shè)OVA為常見致敏原對照、BSA為不常見致敏原對照、PAP為非致敏原對照；進行模擬腸液消化穩(wěn)定性試驗，設(shè)OVA為常見致敏原對照、BSA為不常見致敏原對照、LPE為非致敏原對照。 結(jié)果： 1.B N大鼠致敏動物模型的實驗研究經(jīng)口致敏模型：特異性抗體ELISA結(jié)果顯示第14、28、42天OVA均激發(fā)較高的特異性IgG抗體，平均log<,2>IgG滴度分別為10.5、12.3、12；PAP激

8、發(fā)的特異性IgG抗體滴度則較低，平均log<,2>IgG滴度分別為4、4.3、3.3；OVA激發(fā)一定程度的特異性IgE抗體，平均log<,2>IgE滴度分別為2、3.1、2.6，；而PAP未能激發(fā)特異性IgE抗體。PCA試驗結(jié)果顯示第14、28、42天OVA激發(fā)特異性IgE抗體滴度分別為1：2、1：4、1：2，PAP未能激發(fā)特異性IgE抗體。組胺測定結(jié)果第21天OVA組大鼠血漿中組胺含量較陰性對照組升高，有統(tǒng)計學差異(p<0.05)，O

9、VA組第35天和PAP組血漿中組胺含量較陰性對照組無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。血壓和腸滲透性均未測得有所改變。腹腔注射致敏模型：OVA+A1(OH)<,3>組有一只大鼠血壓出現(xiàn)暫時性下降，很快恢復(fù)正常。特異性抗體ELISA結(jié)果顯示第14、28、42天OVA激發(fā)較高的特異性IgG抗體，平均log<,2>IgG滴度分別為14.8、16.7、17；OVA+A1(OH)<,3>激發(fā)較高的特異性IgG抗體，平均log<,2>IgG滴度分別為17

10、.6、16.1、17.7；PAP激發(fā)的特異性IgG抗體滴度則較低，平均log<,2>IgG滴度分別為4.6、5、3.4；OVA和OVA+Al(OH)<,3>都激發(fā)較高的特異性IgE抗體，OVA組平均log<,2>IgE滴度分別為4.3、5.1、3.8，OVA+A1(OH)<,3>組平均log<,2>IgE滴度分別為6、7.4、5.6；而PAP未能激發(fā)特異性IgE抗體。PCA試驗結(jié)果顯示第14、28、42天OVA激發(fā)特異性IgE抗體滴度分

11、別為1：8、1：16、1：4，OVA+Al(OH)<,3>激發(fā)特異性IgE抗體滴度分別為1：16、1：64、1：16，PAP未能激發(fā)特異性IgE抗體。組胺測定結(jié)果第21、35天OVA和OVA+Al(OH)<,3>組大鼠血漿中組胺含量較陰性對照組升高，有統(tǒng)計學差異(p<0.05)，PAP組血漿中組胺含量較陰性對照組無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。腸滲透性檢測結(jié)果顯示OVA組有一只大鼠在0.5小時血清中測得β-LG，OVA+Al(OH)<,3

12、>組有一只大鼠在0.5和l小時血清中都測得β-LG，一只大鼠在0.5小時血清中測得β-LG。 2.體外模擬消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性模型研究OVA在模擬胃腸液中60min不降解穩(wěn)定存在，可作為模擬胃腸液消化穩(wěn)定性的陽性對照；但β-LG在模擬腸液中30min內(nèi)完全降解，因此不可作為模擬腸液消化穩(wěn)定性陽性對照；BSA在模擬胃液中30min內(nèi)完全降解，在模擬腸液中60min部分降解，可用作不常見致敏原蛋白對照；PAP在模擬胃液中15s即完全

13、降解，LPE在30s內(nèi)完全降解，都可作為模擬胃液消化穩(wěn)定性的陰性對照；而在模擬腸液中PAP 60min完全不降解，LPE 60min大部分降解，因此在模擬腸液消化穩(wěn)定性試驗中應(yīng)選LPE為陰性對照。在熱穩(wěn)定性試驗中，OVA、β-LG、BSA60min內(nèi)不降解，都可作陽性對照，PAP 60min內(nèi)完全降解，可作為陰性對照。 3.胡桃蛋白Jug r 1的原核表達與純化工程菌進行質(zhì)粒測序結(jié)果顯示克隆構(gòu)建成功。表達蛋白的可溶性分析標明目的

14、蛋白以不溶的包涵體形式存在。優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件發(fā)現(xiàn)IPTG 0.1mM誘導(dǎo)4小時時，Jug r 1蛋白表達量最高。大量表達、分離和純化后將包涵體溶于6M鹽酸胍的包涵體溶解液中，并通過透析方法使其復(fù)性得到Jug r 1蛋白溶液，考馬斯亮蘭G250法測定蛋白含量為393.9μg/ml，使用低溫真空離心濃縮干燥機濃縮溶液，得到終濃度為10mg/ml的Jug r1溶液。重復(fù)此過程得到約60ml的10mg/ml的Jug r 1溶液。 4.J

15、ug r 1的致敏性研究體內(nèi)試驗結(jié)果顯示施以受試蛋白Jug r 1處理的大鼠并未出現(xiàn)異常血壓，只激發(fā)了很低的特異性IgE抗體滴度(第28天時最高，僅為1：2)，組胺較陰性對照組無統(tǒng)計學差異，腸滲透性亦未測得改變。 結(jié)論： 1.本研究通過經(jīng)口和腹腔注射兩種常見致敏途徑，以常見致敏食物蛋白質(zhì)OVA、無致敏史的食物蛋白質(zhì)PAP給予BN大鼠，并選取有代表性的循環(huán)系統(tǒng)指標(血壓)、免疫指標(特異性IgE抗體、組胺)和胃腸系統(tǒng)指標(

16、腸滲透性)作為判斷終點，發(fā)現(xiàn)OVA可激發(fā)BN大鼠的過敏反應(yīng)，而PAP則不能。本研究認為BN大鼠致敏動物模型是評價食品致敏性較適合的動物模型，OVA和PAP可分別作為模型的陽性和陰性對照蛋白，血壓、特異性IgE(ELISA法)和組胺以及腸滲透性(ELISA法)作為評價指標，并且致敏模型的應(yīng)用中不宜使用免疫佐劑。據(jù)此初步建立了致敏動物模型，為研究后期和將來的食物致敏性研究打下了基礎(chǔ)，并提供了可靠的技術(shù)手段。 2.體外模擬胃腸消化環(huán)境

17、、熱加工處理環(huán)境，研究了不同致敏性的標準蛋白的消化和熱穩(wěn)定性，確定適宜用于體外模擬消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性試驗的參照蛋白：模擬胃液消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性試驗中設(shè)OVA為常見致敏原對照、BSA為不常見致敏原對照、PAP為非致敏原對照，模擬腸液消化穩(wěn)定性試驗中設(shè)OVA為常見致敏原對照、BSA為不常見致敏原對照、LPE為非致敏原對照。建立了體外模擬消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性模型，為評價其他蛋白質(zhì)是否具有致敏原蛋白特征提供了依據(jù)和手段。 3.通過大

18、腸桿菌原核表達胡桃蛋白質(zhì)Jug r 1。對誘導(dǎo)表達條件、純化方法、蛋白質(zhì)變性復(fù)性條件的嘗試和摸索，最終得到純度較高的Jug r 1蛋白質(zhì)溶液，為后期Jug r1致敏性研究做好了準備。 4．利用前期建立的體內(nèi)和體外模型，對原核表達的Jug r1的致敏性進行了一定的研究。體內(nèi)試驗該蛋白并未顯示出致敏性，而體外試驗結(jié)果卻提示該蛋白具有致敏原的特征(與牛血清白蛋白相似)，體內(nèi)外試驗結(jié)果的差異可能與BN大鼠的敏感性和蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)有關(guān)。