CLC-3蛋白在糖尿病大鼠主動(dòng)脈平滑肌，腎臟及腦組織中的表達(dá)及變化的研究.pdf

1、研究目的：本課題擬采用分子生物學(xué)檢測方法，在糖尿病形成的不同時(shí)期(2周、4周、8周、12周、16周)，觀察大鼠主動(dòng)脈平滑肌，腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)及腦組織CLC-3蛋白的表達(dá)。從分子生物學(xué)角度探討在糖尿病高滲透壓狀態(tài)下，CLC-3蛋白如何發(fā)生變化。并探討其可能機(jī)制，為揭示糖尿病時(shí)血管功能的損害機(jī)制及其藥物研制的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 研究方法：選用50只200～250g正常雄性Wistar大鼠一次性腹腔注射STZ誘導(dǎo)成糖尿病后，隨機(jī)分成五

2、個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即2周，4周，8周，12周和16周。另外取50只年齡、體重相匹配的正常雄性Wistar大鼠作為正常對照組。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物十只。迅速取出各組主動(dòng)脈、腎臟(皮質(zhì)、髓質(zhì))及腦組織。取不同時(shí)期大鼠相應(yīng)待測組織放入預(yù)冷的PBS緩沖液中，把動(dòng)脈周圍結(jié)締組織剪干凈去除血塊洗三遍，加入三倍組織量的組織裂解液，在冰浴下用組織勻漿器勻漿，將組織完全裂解呈乳狀，高速低溫(4℃)離心機(jī)3000g，在4℃，離心5min，取上清后再次離心，腎臟皮質(zhì)，

3、髓質(zhì)以及腦組織用PBS沖洗三遍后，離心機(jī)12000g在4℃，離心2min，取上清，將上清液置于EP管中，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?可保存1周)。取少量蛋白上清液用考馬斯亮蘭法定量后，調(diào)整蛋白量，使每個(gè)加樣孔中蛋白量相同。加入6×上樣緩沖液(為上樣液的1/5量)沸水中煮3-5分鐘，迅速冰浴(0℃)3分鐘，混勻。與5ulMarker一起進(jìn)行SDS-PAGE電泳，約2h，電泳分離蛋白質(zhì)然后卸下分離膠，置于電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡30min。轉(zhuǎn)移到硝酸

4、纖維素膜上，PBST洗脫液沈脫5min。將卸下的硝酸纖維素膜浸于封閉液(5％脫脂奶粉)中，室溫下在搖床緩慢搖勻1小時(shí)，取出膜后，在將膜放入CLC-3多克隆抗體與β-actin抗體(混合液中，在搖床上緩慢搖勻孵育1小時(shí)，PBST室溫洗脫1小時(shí)，將硝酸纖維素膜放入在HRP-結(jié)合的二抗室溫下共同孵育1小時(shí)，PBST洗脫1小時(shí)，每3分鐘取發(fā)光試劑盒中的發(fā)光底物溶液和增強(qiáng)劑溶液各0.25ml，加入去離子水稀釋至5ml，混勻靜置1分鐘后，與膜作用3

5、min，在暗室中，使X片感光。膠片用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析灰度。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用(-X)±S表示，組間分析用MicrosoftExcelt檢驗(yàn)，p＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 試驗(yàn)結(jié)果： 1.用抗CLC-3的多克隆抗體在大鼠主動(dòng)脈平滑肌，腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)以及腦組織上均檢測到內(nèi)源性CLC-3蛋白的表達(dá)，它們的分子量在80KDa-110KDa之間。 2.糖尿病大鼠主動(dòng)脈平滑肌上CLC-3

6、蛋白的表達(dá)在2周后升高，在第8周和12周時(shí)表達(dá)與對照組有顯著性差異(P＜0.05). 3.糖尿病大鼠腎臟皮質(zhì)上CLC-3蛋白的表達(dá)在第2周到12周時(shí)均升高，在第16周時(shí)表達(dá)降低，與對照組沒有顯著性差異。髓質(zhì)上CLC-3蛋白的表達(dá)在第2周到16周時(shí)均降低，在第12周和16周時(shí)表達(dá)與對照組有顯著性差異(P＜0.05)。 4.糖尿病大鼠腦組織上CLC-3蛋白的表達(dá)在第2周到16周時(shí)均升高，在第12周和16周時(shí)表達(dá)與對照組有顯著

7、性差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.免疫印跡表明大鼠主動(dòng)脈平滑肌，腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)以及腦組織上均檢測到內(nèi)源性CLC-3蛋白的表達(dá)，它們的分子量在80KDa-110KDa之間。 2.糖尿病大鼠發(fā)病早期第2周到第4周時(shí)主動(dòng)脈平滑肌，腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)以及腦組織上CLC-3蛋白的表達(dá)與對照組均沒有顯著性差異，在中后期第8周開始有顯著性變化。 3.糖尿病大鼠主動(dòng)脈平滑肌，腎臟皮質(zhì)及腦組織上CLC-3蛋白的表達(dá)在糖尿病