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文檔簡介
1、研究目的:本課題擬采用分子生物學(xué)檢測方法,在糖尿病形成的不同時(shí)期(2周、4周、8周、12周、16周),觀察大鼠主動(dòng)脈平滑肌,腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)及腦組織CLC-3蛋白的表達(dá)。從分子生物學(xué)角度探討在糖尿病高滲透壓狀態(tài)下,CLC-3蛋白如何發(fā)生變化。并探討其可能機(jī)制,為揭示糖尿病時(shí)血管功能的損害機(jī)制及其藥物研制的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 研究方法:選用50只200~250g正常雄性Wistar大鼠一次性腹腔注射STZ誘導(dǎo)成糖尿病后,隨機(jī)分成五
2、個(gè)時(shí)間點(diǎn),即2周,4周,8周,12周和16周。另外取50只年齡、體重相匹配的正常雄性Wistar大鼠作為正常對照組。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物十只。迅速取出各組主動(dòng)脈、腎臟(皮質(zhì)、髓質(zhì))及腦組織。取不同時(shí)期大鼠相應(yīng)待測組織放入預(yù)冷的PBS緩沖液中,把動(dòng)脈周圍結(jié)締組織剪干凈去除血塊洗三遍,加入三倍組織量的組織裂解液,在冰浴下用組織勻漿器勻漿,將組織完全裂解呈乳狀,高速低溫(4℃)離心機(jī)3000g,在4℃,離心5min,取上清后再次離心,腎臟皮質(zhì),
3、髓質(zhì)以及腦組織用PBS沖洗三遍后,離心機(jī)12000g在4℃,離心2min,取上清,將上清液置于EP管中,放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?可保存1周)。取少量蛋白上清液用考馬斯亮蘭法定量后,調(diào)整蛋白量,使每個(gè)加樣孔中蛋白量相同。加入6×上樣緩沖液(為上樣液的1/5量)沸水中煮3-5分鐘,迅速冰浴(0℃)3分鐘,混勻。與5ulMarker一起進(jìn)行SDS-PAGE電泳,約2h,電泳分離蛋白質(zhì)然后卸下分離膠,置于電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡30min。轉(zhuǎn)移到硝酸
4、纖維素膜上,PBST洗脫液沈脫5min。將卸下的硝酸纖維素膜浸于封閉液(5%脫脂奶粉)中,室溫下在搖床緩慢搖勻1小時(shí),取出膜后,在將膜放入CLC-3多克隆抗體與β-actin抗體(混合液中,在搖床上緩慢搖勻孵育1小時(shí),PBST室溫洗脫1小時(shí),將硝酸纖維素膜放入在HRP-結(jié)合的二抗室溫下共同孵育1小時(shí),PBST洗脫1小時(shí),每3分鐘取發(fā)光試劑盒中的發(fā)光底物溶液和增強(qiáng)劑溶液各0.25ml,加入去離子水稀釋至5ml,混勻靜置1分鐘后,與膜作用3
5、min,在暗室中,使X片感光。膠片用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析灰度。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用(-X)±S表示,組間分析用MicrosoftExcelt檢驗(yàn),p<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 試驗(yàn)結(jié)果: 1.用抗CLC-3的多克隆抗體在大鼠主動(dòng)脈平滑肌,腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)以及腦組織上均檢測到內(nèi)源性CLC-3蛋白的表達(dá),它們的分子量在80KDa-110KDa之間。 2.糖尿病大鼠主動(dòng)脈平滑肌上CLC-3
6、蛋白的表達(dá)在2周后升高,在第8周和12周時(shí)表達(dá)與對照組有顯著性差異(P<0.05). 3.糖尿病大鼠腎臟皮質(zhì)上CLC-3蛋白的表達(dá)在第2周到12周時(shí)均升高,在第16周時(shí)表達(dá)降低,與對照組沒有顯著性差異。髓質(zhì)上CLC-3蛋白的表達(dá)在第2周到16周時(shí)均降低,在第12周和16周時(shí)表達(dá)與對照組有顯著性差異(P<0.05)。 4.糖尿病大鼠腦組織上CLC-3蛋白的表達(dá)在第2周到16周時(shí)均升高,在第12周和16周時(shí)表達(dá)與對照組有顯著
7、性差異(P<0.05)。 結(jié)論: 1.免疫印跡表明大鼠主動(dòng)脈平滑肌,腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)以及腦組織上均檢測到內(nèi)源性CLC-3蛋白的表達(dá),它們的分子量在80KDa-110KDa之間。 2.糖尿病大鼠發(fā)病早期第2周到第4周時(shí)主動(dòng)脈平滑肌,腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)以及腦組織上CLC-3蛋白的表達(dá)與對照組均沒有顯著性差異,在中后期第8周開始有顯著性變化。 3.糖尿病大鼠主動(dòng)脈平滑肌,腎臟皮質(zhì)及腦組織上CLC-3蛋白的表達(dá)在糖尿病
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