抑制纖維連接蛋白的合成誘導大鼠系膜細胞凋亡的機制研究.pdf

1、目的：腎小球硬化和/或間質纖維化是腎臟疾病走向終末期腎功能衰竭的最終途徑。腎臟纖維化過程中普遍存在著細胞外基質(ECM)的過度積聚和細胞增殖。纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是ECM重要成分之一，在細胞粘附、移動、增殖等方面起著極其重要的作用。在大多數(shù)腎小球硬化及間質纖維化中都可觀察到FN的過度積聚。本研究目的在于，利用RNAi(RNAinterference)技術，直接抑制內(nèi)源性FN的合成。觀察FN的缺失對大鼠腎臟系膜細胞

2、增殖與凋亡的影響。進而闡明凋亡的途徑以及細胞內(nèi)鈣離子的異常在凋亡中的作用。 方法：分離并培養(yǎng)大鼠原代腎小球系膜細胞。體外合成siRNA(smallinterferenceRNA)，選取抑制效果最佳的片段。構建表達shRNA(smallhairinRNA)的逆轉錄病毒載體，穩(wěn)定抑制大鼠系膜細胞FN的表達。應用實時定量PCR、Westernblot、細胞免疫熒光檢測FN的表達水平。應用JC-1染色檢測線粒體功能。流式細胞儀技術檢測凋

3、亡細胞數(shù)量。在細胞培養(yǎng)過程中加入環(huán)孢霉素A、外源性FN以及caspase3、8的阻斷劑，判定細胞凋亡的途徑。利用共聚集顯微鏡檢測應激條件下內(nèi)質網(wǎng)InsP3(1,4,5-triphosphatereceptor)受體及RyR(Ryanodinereceptor)鈣通道的開放情況。在誘導凋亡過程中加入L型鈣通道阻斷劑及內(nèi)質網(wǎng)鈣InsP3受體及RyR鈣通道阻斷劑，確定鈣離子在FN缺失導致凋亡中的作用。 結果：合成的siRNA及逆轉錄病

4、毒載體所表達的shRNA都可以有效地抑制系膜細胞FN的合成，而且長時間的抑制會導致系膜細胞出現(xiàn)凋亡。FN缺失后出現(xiàn)的細胞凋亡過程中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性凋亡途徑的主要成分細胞色素c釋放、caspase9和caspase3的激活；而外源性凋亡途徑的最主要成分caspase8的表達沒有明顯變化，并且caspase8被特異阻斷后，不影響FN缺失誘發(fā)的細胞凋亡。該結果提示內(nèi)源性凋亡途徑的啟動是FN缺失后細胞凋亡的原因，而外源性凋亡途徑在此凋亡中不起主要作

5、用。進一步對凋亡啟動機制的研究中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質網(wǎng)InsP3受體及RyR鈣通道在應激條件下，對胞漿鈣的升高起著不同的作用。在FN缺失后的細胞凋亡中，內(nèi)質網(wǎng)InsP3鈣通道開放導致的胞漿鈣離子增加是誘導細胞凋亡的主要原因。 結論：①RNAi方法是有效的基因抑制工具。本研究所構建的以逆轉錄病毒載體為基礎的shRNA表達系統(tǒng)，為基因的功能研究和臨床治療提供了新的方法。②FN的缺失可以誘導系膜細胞出現(xiàn)內(nèi)源性途徑的凋亡。③細胞外基質成分的改變，