Ang-1在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)和青蒿琥酯、β-欖香烯抗骨髓瘤效應(yīng).pdf

1、第一部分 Ang-1在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及臨床意義
　　 目的:骨髓血管新生在多發(fā)性骨髓瘤(multipie myeloma,MM)的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中起著重要的作用,血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)在此過程中扮演了重要角色。本課題旨在研究Ang-1及其受體Tie-2在MM患者和骨髓瘤細(xì)胞株RPMI-8226中的表達(dá)情況,探討其表達(dá)水平變化的臨床意義。
　　 方法:采用RT-PCR和Weste

2、rn blot法檢測(cè)112例MM患者、24例非腫瘤患者(下稱對(duì)照組)以及RPMI-8226細(xì)胞株中Ang-1及其受體Tie-2的表達(dá)水平,分析陽性率及表達(dá)量在MM患者與對(duì)照組、MM不同分期問的差異,探討Ang-1表達(dá)與MM患者骨髓微血管密度、臨床分期及預(yù)后的關(guān)系。
　　 結(jié)果:MM組Ang-1表達(dá)的陽性率、表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);Ang-1在初治組和復(fù)發(fā)/難治MM組的表達(dá)陽性率無明顯差異(P＞0.05),但復(fù)發(fā)/

3、難治MM組的Ang-1表達(dá)量高于初治組(P＜0.05);Tie-2mRNA僅在12例MM患者中檢出,對(duì)照組未檢出。MM患者骨髓微血管密度明顯高于對(duì)照組(25.21±0.8 vs5.23±0.2,P＜0.01);Ang-1陽性患者的骨髓微血管密度高于Ang-1陰性患者(32.98±1.7 vs16.55±1.3,P＜0.05);Ang-1蛋白在Ⅱ期和Ⅲ期MM患者的表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(52.1％ vs60.9％,P＞0.05),但Ⅲ

4、期MM患者Ang-1蛋白的表達(dá)水平明顯高于Ⅱ期患者(0.4±0.07 vs0.22±0.04,P＜0.05);初治患者中,治療無效組Ang-1蛋白表達(dá)陽性率明顯高于有效組(19.1％ vs70.0％,P＜0.01)。
　　 結(jié)論:Ang-1在MM中高表達(dá);Ang-1表達(dá)水平與MM臨床分期、判斷預(yù)后及選擇靶向治療有關(guān)。
　　 第二部分青蒿琥酯抑制人骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生
　　 目的:觀察青蒿琥酯對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株R

5、PMI-8226細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生的影響,并探討其機(jī)制。
　　 方法:采用MTT法觀察青蒿琥酯對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI-8226細(xì)胞增殖的影響;采用HUVEC遷移實(shí)驗(yàn)、HUVEC小管成型實(shí)驗(yàn)、主動(dòng)脈環(huán)血管生成實(shí)驗(yàn)和雞胚絨毛尿囊膜(CAM)體內(nèi)血管生長實(shí)驗(yàn)觀察青蒿琥酯對(duì)RPMI-8226細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的影響;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)RPMI-8226細(xì)胞分泌VEGF租Ang-1的影響;免疫蛋白印跡法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)RPMI

6、-8226細(xì)胞VEGF和Ang-1蛋白表達(dá)的影響,
　　 結(jié)果:
　　 1青蒿琥酯以時(shí)間、劑量依賴方式抑制人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI-8226細(xì)胞增殖。藥物作用24 h和48 h后,其IC50值分別為36.33±2.65和14.31±3.28μmol/l。
　　 2青蒿琥酯在較低濃度(2.5μmol/l)即開始對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移有抑制作用;12.5μmol/1時(shí)即可抑制內(nèi)皮小管形成。
　　 3主動(dòng)脈環(huán)血管生成

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與單純RPMI-8226細(xì)胞組相比,青蒿琥酯預(yù)處理組新生血管形成明顯減少,出現(xiàn)時(shí)間明顯滯后。第14天,單純RPMI8226細(xì)胞組新生血管數(shù)為114.5±1.87;3、6和12μmol/l青蒿琥酯預(yù)處理組新生血管數(shù)分別為60.33±1.86、34.83±2.14和10±1.41,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4雞胚絨毛尿囊膜(CAM)體內(nèi)血管生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,單純RPMI-8226細(xì)胞組具有很強(qiáng)的刺激血

8、管新生能力;而ART處理組的RPMI-8226細(xì)胞刺激血管新生能力明顯減弱,3、6和12μmol/l青蒿琥酯處理RPMI-8226細(xì)胞組與單純RPMI8226細(xì)胞組比較,微血管數(shù)目分別減少21.9％,38.24％和76.9％。
　　 5青蒿琥酯抑制人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI-8226細(xì)胞分泌VEGF和Ang-1。與單純RPMI-8226細(xì)胞對(duì)照組上清液中VEGF、Ang-1含量(578±26、185.14±32 pg/ml)相比,經(jīng)

9、3、6和12μmol/l青蒿琥酯處理的RPMI8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液中VEGF、Ang-1含量下降,分別為502±27、145±21;227±35、65±18:121±14、36±6 pg/ml。
　　 6青蒿琥酯抑制人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI-8226細(xì)胞VEGF和Ang-1蛋白表達(dá)。與單純RPMI8226細(xì)胞對(duì)照組相比,經(jīng)3、6和12μmol/l青蒿琥酯處理的RPMI8226細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量分別下降28.2％、57.1％和

10、73.6％;Ang-1蛋白表達(dá)量分別下降28.9％、44.4％和71.1％,呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論:青蒿琥酯抑制人骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞增殖;青蒿琥酯抑制人骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生;青蒿琥酯抗骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的效應(yīng)與其抑制RPMI-8226細(xì)胞的VEGF、Ang-1表達(dá)有關(guān)。
　　 第三部分β-欖香烯對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響
　　 目的:研究β-欖香烯對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞系RPM

11、I-8226增殖、凋亡的影響,探討其作用的分子機(jī)制
　　 方法:用MTT法檢測(cè)β-欖香烯對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞系RPMI-8226增殖的影響;Annexin V/PI雙標(biāo)流式術(shù)和Hoechst33342/PI熒光染色檢測(cè)β-欖香烯對(duì)RPMI-8226骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響;Western blot法檢測(cè)β-欖香烯對(duì)RPMI-8226骨髓瘤細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3、DR-4和NF-κB p65蛋白表達(dá)影響。
　　 結(jié)果:β

12、-欖香烯對(duì)RPMI-8226骨髓瘤細(xì)胞生長具有明顯抑制作用,且呈濃度和時(shí)間依賴性(r=0.723,P＜0.05);10～80μmol/L范圍β-欖香烯作用48 h后可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡。與對(duì)照組凋亡率(5.4％±1.1％)相比,β-欖香烯處理組凋亡率隨藥物濃度而遞增,分別為22.1％±3.8％(10μmol/L)、39.5％±3.1％(20μmol/L)、58.4％±2.8％(40μmol/L)、65.4％±2.1％(80μmol/L)