交感神經(jīng)經(jīng)β腎上腺素能受體途徑調(diào)控急性肝損傷的研究.pdf

1、一、背景:
　　 肝臟大范圍手術或肝外傷和嚴重的細菌或病毒感染以及藥物中毒可引起急性肝損傷，造成肝臟功能不全甚至繼續(xù)進展導致肝功能衰竭而使患者死亡。而目前對于急性肝損傷的救治，臨床上的藥物治療效果仍然十分有限，其機制也不十分明確。
　　 肝組織內(nèi)炎癥反應的調(diào)控可分為體液調(diào)控和神經(jīng)調(diào)控兩方面。目前對肝臟炎癥反應的調(diào)控研究主要在體液調(diào)控方面，而神經(jīng)調(diào)控研究相對較少。近年來研究表明，刺激交感神經(jīng)興奮可使炎癥狀態(tài)下的肝損傷加重，

2、而去除交感神經(jīng)則可緩解肝損傷，促進肝損傷的恢復。
　　 國外及我們前期的研究表明，交感神經(jīng)可通過分泌去甲腎上腺素激動Kupffer細胞上的α腎上腺素能受體而調(diào)控肝臟炎癥的進展；Kupffer細胞上同樣也分布有β腎上腺素能受體，有研究報道在敗血癥后期，Kupffer細胞上β腎上腺素能受體表達上升并與炎癥調(diào)控有關系。但這一調(diào)控途徑的分子機制至今仍不清楚。因此我們設計了以下實驗以探討交感神經(jīng)興奮是否通過β腎上腺素能受體途徑來調(diào)控急性肝

3、損傷，以及這一作用的分子機制。
　　 一、目的:
　　 本實驗研究應用β腎上腺素能受體激動劑和阻滯劑作用于急性肝損傷大鼠，觀察其對急性肝損傷大鼠肝功能的影響；并通過在體和離體研究探討Kupffer細胞在交感神經(jīng)經(jīng)β腎上腺素能受體途徑調(diào)控急性肝損傷中的作用及其機制。
　　 三、方法:
　　 1 SD大鼠腹腔內(nèi)注射ISO(異丙腎上腺素)，激動β腎上腺素能受體，模擬交感神經(jīng)興奮β腎上腺素能受體，以正常大鼠為陰性

4、對照，應用全自動生化檢測儀檢測外周血中ALT、AST、Alb、TBil的變化情況，肝臟組織HE染色觀察病理學變化，明確ISO是否具有肝臟毒性。
　　 2以不同劑量(1、10、100mg/kg)ISO激動β腎上腺素能受體，應用CCl4造成大鼠急性肝損傷，并在不同的損傷時相點(24、48、72、96h)取材，以無β腎上腺素能受體激動的急性肝損傷大鼠為陰性對照，檢測外周血中ALT、AST、Alb、TBil的變化，HE染色觀察病理學變化

5、，探討β腎上腺素能受體激動劑對急性肝損傷調(diào)控的劑量和時間依賴性。
　　 3 SD大鼠腹腔內(nèi)注射PRO(普萘洛爾)，阻斷β腎上腺素能受體激動，抑制交感神經(jīng)興奮，應用CCl4造成大鼠急性肝損傷，以無β腎上腺素能受體阻滯的急性肝損傷大鼠為陰性對照，應用全自動生化檢測儀檢測外周血中ALT、AST、Alb、TBil的變化情況，HE染色觀察病理學變化，探討阻斷β腎上腺素能受體激動對急性肝損傷的影響。
　　 4 SD大鼠腹腔內(nèi)先注射氯

6、化釓消除大鼠肝臟內(nèi)的Kupffer細胞后，再注射ISO，興奮β腎上腺素能受體，應用CCl4造成大鼠急性肝損傷，以無β腎上腺素能受體激動的急性肝損傷大鼠為陰性對照，應用全自動生化檢測儀檢測外周血中ALT、AST、Alb、TBil的變化情況，HE染色觀察病理學變化，探討Kupffer細胞在β腎上腺素能交感神經(jīng)調(diào)控急性肝損傷中的作用。
　　 5應用肝臟原位灌注、Ⅳ型膠原酶消化、Percoll密度梯度離心和選擇性貼壁等方法分離純化得到K

7、upffer細胞并進行吞噬實驗和ED2細胞免疫染色來鑒定。
　　 6 Kupffer細胞體外分四組培養(yǎng)：PBS組、LPS組、ISO+LPS組、PRO+ISO+LPS組，使用ELISA檢測IL-6的表達、real-time PCR檢測TIMP-1 mRNA的表達情況，初步探索交感神經(jīng)經(jīng)β腎上腺素能受體途徑調(diào)控急性肝損傷中的機制。
　　 四、結果:
　　 1單純注射ISO和正常大鼠在各項肝功能指標沒有統(tǒng)計學差異(P>

8、0.05)，ISO不會造成肝損傷。
　　 2大鼠肝損傷程度隨著ISO劑量的加大而加重(ALT：對照組336.2±140.5，1mg/kg組603.7±239.7，10mg/kg組838.6±448.5，100mg/kg組1571.5±714.7，P<0.05)；在急性肝損傷后第48h對照組與實驗組各項肝功能指標均有統(tǒng)計學差異(ALT：290.8±153.9，636.0±385.2，P<0.05；AST：521.0±296.8，2

9、289.1±1361.5，P<0.05；Alb：28.3±1.3，25.2±1.5，P<0.05；TBil：4.1±1.2，24.8±16.9，P<0.05)。
　　 3應用PRO阻滯β腎上腺素能受體興奮，可有效防止大鼠急性肝損傷加重(ALT：激動組606.0±154.9，阻滯組210.0±176.1，P<0.05)。
　　 4在去除了Kupffer細胞的情況下，實驗組和對照組相比，肝功能檢測指標ALT、AST、TBil

10、均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 5 Latex-Beads顆粒吞噬實驗提示95％以上的細胞具有吞噬能力，ED2抗體染色提示90%以上的細胞為染色陽性細胞。
　　 6 ELISA檢測各組IL-6的表達：各實驗組IL-6的濃度與PBS組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；ISO+LPS組IL-6濃度比LPS組低且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；PRO+ISO+LPS組IL-6濃度相比ISO+LPS組升高且具有統(tǒng)計學差

11、異(P<0.05)。Real-time PCR檢測各組TIMP-1 mRNA的表達：各實驗組TIMP-1 mRNA相對表達量與PBS組相比，均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；ISO+LPS組TIMP-1 mRNA相對表達量比LPS組低且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；PRO+ISO+LPS組TIMP-1 mRNA相對表達量相比ISO+LPS組升高且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 五、結論:
　　 1應用β腎上腺素能

12、受體激動劑，可加重CCl4所致大鼠急性肝損傷，當阻滯β腎上腺素能受體的激動，可緩解CCl4所致大鼠急性肝損傷。因此，交感神經(jīng)可經(jīng)β腎上腺素能受體途徑來調(diào)控急性肝損傷的進程。
　　 2當去除大鼠肝臟Kupffer細胞后，再興奮β腎上腺素能受體不能加重CCl4所致大鼠急性肝損傷。Kupffer細胞在交感神經(jīng)調(diào)控急性肝損傷過程中起到了媒介的作用。
　　 3交感神經(jīng)激動KupfFer細胞上的β腎上腺素能受體，顯著抑制IL-6和T