通心絡(luò)對局灶性腦缺血大鼠微血管新生及其代償作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本研究以絡(luò)病理論為指導(dǎo),采用開顱結(jié)扎法阻斷大鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈制作局灶性腦缺血大鼠模型,選用絡(luò)病理論的代表方劑—通心絡(luò),通過觀察行為學(xué)評分、腦梗死面積的變化,以及對局灶性腦缺血大鼠微血管密度、直徑和血流灌注量、微血管新生相關(guān)因子及其表達(dá)的影響,以期從促進(jìn)腦微血管新生角度探討通心絡(luò)對缺血性腦卒中神經(jīng)功能恢復(fù)的治療作用,為絡(luò)病理論在缺血性腦血管病應(yīng)用中的科學(xué)價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。
　　 方法:
　　 1：通心絡(luò)對局灶性腦

2、缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)和腦梗死面積的影響。
　　 健康SPF級雄性SD大鼠,隨機(jī)分為六組:假手術(shù)組、模型組、通心絡(luò)大劑量組(2.4g/kg·d)、通心絡(luò)中劑量組(1.2g/kg·d)、通心絡(luò)小劑量組(0.6g/kg·d)、尼莫地平組(10mg/kg·d)。采用開顱結(jié)扎法阻斷大鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈制作局灶性腦缺血大鼠模型,假手術(shù)組大鼠只挑開腦膜,不結(jié)扎血管。各用藥組均在動(dòng)物蘇醒后灌胃,假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,各組分別于術(shù)后

3、3d,7d,14d分批處死部分動(dòng)物(n=6)。通過姿勢反射試驗(yàn)、前肢肌力測試試驗(yàn)、橫木行走試驗(yàn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分,HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)改變,TTC染色測定腦梗死面積變化。
　　 2：通心絡(luò)對局灶性腦缺血大鼠微血管密度、直徑及血流灌注量的影響:
　　 實(shí)驗(yàn)造模及分組、給藥方法同前,各組于術(shù)后14d,心臟灌注固定,免疫組化方法檢測大腦皮層缺血區(qū)微血管密度;用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖苷(FITC-dextran)股靜脈注射

4、標(biāo)記血漿,1min后斷頭取腦,腦組織固定后振動(dòng)切片機(jī)冠狀切片,用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行掃描,將所獲得的圖像進(jìn)行三維重建,用綠色熒光所占的體積表示血漿容量與掃描區(qū)總?cè)萘康陌俜直缺硎狙鞴嘧⒘?用40倍光鏡下獲得的圖像觀察數(shù)目和血管形態(tài)。
　　 3：通心絡(luò)對局灶性腦缺血大鼠血管新生相關(guān)因子及其表達(dá)的影響:
　　 實(shí)驗(yàn)造模及分組、給藥方法同前,各組于術(shù)后14d,頸動(dòng)脈采血和斷頭取腦,常規(guī)分離血清后,按試劑盒說明書要求測定血清NO

5、、VEGF水平;采用免疫組化方法測定缺血腦組織VEGF、Ang-1、Ang-2的蛋白表達(dá);以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測腦組織Ang-1 mRNA和Ang-2 mRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1：通心絡(luò)對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)和腦梗死面積的影響。
　　 神經(jīng)行為學(xué)評分結(jié)果:腦缺血3d后,通心絡(luò)大劑量明顯改善局灶性腦缺血模型大鼠行為學(xué)評分(P＜0.05),通心絡(luò)中、小劑量組改善不明顯;腦

6、缺血7d后,通心絡(luò)大、中劑量組和尼莫地平組均能改善腦缺血大鼠行為學(xué)評分(P＜0.05),通心絡(luò)小劑量組改善不明顯;腦缺血14d后,通心絡(luò)大、中、小劑量組和尼莫地平組均能改善腦缺血大鼠行為學(xué)評分(P＜0.05),且通心絡(luò)大劑量組優(yōu)于通心絡(luò)小劑量組(P＜0.05)。
　　 組織形態(tài)學(xué)結(jié)果:假手術(shù)組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,連接緊密,基底膜完整。模型組大鼠細(xì)胞周圍間隙增寬,神經(jīng)細(xì)胞大小不等,毛細(xì)血管萎縮,神經(jīng)細(xì)胞腫脹,排列紊亂,細(xì)胞核深

7、染固縮,部分胞質(zhì)自溶,周圍出現(xiàn)較大空泡,缺血腦組織形態(tài)改變嚴(yán)重。各用藥組大鼠均可見神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變減輕,細(xì)胞輕度腫脹,間質(zhì)較致密,壞死細(xì)胞數(shù)量減少。其中通心絡(luò)大劑量組可見神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變明顯減輕,血管周圍間隙和神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙增寬明顯減輕,優(yōu)于模型組,壞死細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　 腦梗死面積測定結(jié)果:腦缺血3d后,通心絡(luò)大、中劑量組能明顯縮小腦缺血大鼠腦梗死面積(P＜0.01),且通心絡(luò)大劑量組優(yōu)于通心絡(luò)中劑量組(P＜0.0

8、5)。腦缺血7d后,通心絡(luò)大劑量組、通心絡(luò)中劑量組、尼莫地平組均能縮小腦缺血大鼠腦梗死面積(P＜0.05)。腦缺血14d后,通心絡(luò)大、中劑量組均能明顯縮小缺血大鼠腦梗死面積(P＜0.05,P＜0.01)。
　　 2：通心絡(luò)對局灶性腦缺血大鼠微血管密度、直徑及血流灌注量的影響:
　　 微血管密度測定結(jié)果:正常腦組織中有少數(shù)散在分布,模型組蛋白表達(dá)有所增強(qiáng),通心絡(luò)大、中劑量組、尼莫地平組CD31蛋白陽性分布密集且著色顯著,均

9、強(qiáng)于模型組,其中以通心絡(luò)大劑量組為優(yōu)。
　　 腦微血管形態(tài)、直徑測定結(jié)果:與模型組比較,各用藥組大腦皮層微血管均呈現(xiàn)迂曲不規(guī)則形狀,其中通心絡(luò)大劑量組血管明顯呈迂曲、不規(guī)則,微血管分支數(shù)目增多,血管之間靠攏形成連接。假手術(shù)組微血管直徑為6.80±0.93μm,其中6-7μm之間的血管占35％,其余各段分布較少;模型組缺血側(cè)微血管直徑為5.17±0.53μm,多數(shù)(40％)分布在5-6μm之間;通心絡(luò)大劑量組缺血側(cè)微血管直徑為3.

10、35±0.09μm,其中多數(shù)(41％)血管在2-3μm之間,其對側(cè)微血管直徑為3.56±0.23μm,多數(shù)(35％)血管在3-4μm之間;通心絡(luò)中劑量組缺血側(cè)微血管直徑為3.50±0.43μm,其中3-4μm血管占40％,其對側(cè)微血管直徑3.63±0.57gm,其中3-4μm血管占32％,其余各段分布較少;通心絡(luò)小劑量組缺血側(cè)微血管直徑為4.35±0.22μm,多數(shù)(40％)血管在4-5μm之間,其對側(cè)微血管直徑為4.52±0.38μm

11、,多數(shù)(30％)血管在5-6μm之間。
　　 腦血流灌注量測定結(jié)果:通心絡(luò)大、中劑量組、尼莫地平組均能夠促進(jìn)腦缺血皮層區(qū)微血管的血流灌注量(P＜0.01,P＜0.05),其中通心絡(luò)大劑量組對側(cè)的血流灌注量也高于模型組對側(cè)(P＜0.05)。
　　 3：通心絡(luò)對局灶性腦缺血大鼠血管新生相關(guān)因子及其表達(dá)的影響。
　　 血清NO、VEGF水平測定結(jié)果:通心絡(luò)大、中劑量組大鼠血清NO水平明顯提高(P＜0.05,P＜0.01

12、),且通心絡(luò)大劑量組優(yōu)于通心絡(luò)中劑量組(P＜0.05);通心絡(luò)大劑量組大鼠血清VEGF水平顯著提高(P＜0.01),通心絡(luò)大劑量組優(yōu)于通心絡(luò)小劑量組和尼莫地平組(P＜0.05,P＜0.01)。
　　 腦組織VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)結(jié)果:腦缺血14d后,正常腦組織VEGF僅有少量表達(dá),與模型組相比,通心絡(luò)大劑量組表達(dá)顯著加強(qiáng),其余各用藥組雖然表達(dá)有所加強(qiáng),但無意義。正常腦組織皮層促血管生成素極少表達(dá),通心絡(luò)大劑量組

13、和通心絡(luò)中劑量組大腦皮層Ang-1表達(dá)強(qiáng)于模型組,通心絡(luò)大劑量組大腦皮層Ang-2表達(dá)強(qiáng)于模型組,其余各用藥組表達(dá)均有所加強(qiáng),但與模型組比較無明顯差異。
　　 腦組織中Ang-1和Ang-2 mRNA表達(dá)結(jié)果:腦缺血14d后,通心絡(luò)大、中組Ang-1和Ang-2 mRNA的表達(dá)強(qiáng)于模型組(P＜0.05),通心絡(luò)大劑量組Ang-1和Ang-2 mRNA表達(dá)強(qiáng)于通心絡(luò)小劑量組和尼莫地平組(P＜0.05),其余各用藥組與模型組相比,雖