腺苷酸環(huán)化酶多克隆抗體對(duì)大鼠血管源性腦水腫保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的 腦水腫(cerebraledema)是指腦組織內(nèi)液體異常聚積，從而使顱內(nèi)壓升高而引起的一系列臨床癥狀的綜合征，常伴有神經(jīng)功能的障礙、反應(yīng)遲鈍、記憶力下降等，嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)腦疝，導(dǎo)致死亡。由于腦水腫和腦細(xì)胞壞死是導(dǎo)致腦功能障礙的兩大主要原因，而腦細(xì)胞壞死是不可逆的，因而防治腦水腫是臨床上治療的重點(diǎn)，。 目前臨床常用治療VBE的藥物主要有高滲性脫水劑、滲透性利尿劑和糖皮質(zhì)激素等。但多數(shù)藥物都有一定的副作用，如甘

2、露醇具有腎毒性作用，易出現(xiàn)水、電解質(zhì)平衡紊亂，只能在短期內(nèi)應(yīng)用；而且不同病人血管通透性改變程度不同，對(duì)通透性極度增高者甘露醇可能會(huì)滲入其腦組織而發(fā)生反跳現(xiàn)象。且研究表明甘露醇雖可減輕腦水腫癥狀，但其治療是非特異性的。最近的研究還表明甘露醇能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，對(duì)血管內(nèi)皮有直接損害的作用。長(zhǎng)期使用利尿劑易出現(xiàn)水、電解質(zhì)紊亂。糖皮質(zhì)激素易于誘發(fā)上消化道出血、升高血糖，長(zhǎng)期應(yīng)用可導(dǎo)致水鈉潴留而增高血壓。此外還有鈣離子拮抗劑、腦代謝活化劑、自

3、由基清除劑等，以上這些藥物雖然能在一定程度上減輕VBE，但因?yàn)槎紱]有解決其發(fā)病機(jī)理的主要環(huán)節(jié)-BBB受損的問題，故對(duì)以腦白質(zhì)水腫為特征的VBE效果差，加之具有一定的副作用，治療效果不能令人十分滿意。 如何緩解VBE、安全渡過腦水腫、降低病死率和致殘率、提高生存率、改善人類生存和生活質(zhì)量是神經(jīng)科學(xué)研究所面臨的重大難題。近年來研究VBE的發(fā)病機(jī)制以及探討其藥物治療已愈來愈被重視，有關(guān)VBE發(fā)病的機(jī)制目前有多種學(xué)說，如微循環(huán)障礙學(xué)說、

4、鈣離子學(xué)說、膜分子結(jié)構(gòu)紊亂學(xué)說等。VBE的病變基礎(chǔ)是BBB通透性增加，BBB不僅是血-腦間物質(zhì)交換的限制系統(tǒng)，而且也是物質(zhì)進(jìn)出腦轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)界面。 隨著生物膜理論的提出、神經(jīng)生化、組織化學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，電鏡及免疫酶標(biāo)技術(shù)的應(yīng)用，進(jìn)一步肯定了腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和脈絡(luò)叢上皮是BBB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并發(fā)現(xiàn)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞存在獨(dú)特的酶系統(tǒng)，這些酶構(gòu)成一道屏障，阻止相應(yīng)底物入腦，對(duì)BBB的通透性具有不可忽視的作用，從而提出了酶屏障學(xué)說。

5、 近年來的研究陸續(xù)報(bào)道了酶在VBE時(shí)的活性變化。Bingham等對(duì)冷凍損傷后的鼠腦進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)酸性磷酸酶、β-甘油磷酸酶和酸性組織蛋白酶確實(shí)較正常值降低了15％-30％，而β-葡萄苷酸酶增加了20％。國外還有研究報(bào)道，腦缺血早期Na+-K+-ATP酶活性降低。在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)VBE模型中腦毛細(xì)血管和脈絡(luò)叢上多種酶活性增高，包括堿性磷酸酶(AKP)、單胺氧化酶(MAO)、腺苷酸環(huán)化酶(AC)、多巴脫羧酶、二磷酸吡啶核苷酸酶和與

6、糖代謝有關(guān)的乳酸脫氫酶(LDH)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)等。此后研究進(jìn)一步證實(shí)除了這些酶活性增高外，還伴隨有BBB通透性的增加。在此基礎(chǔ)上有研究表明通過應(yīng)用酶抑制劑抑制這些酶的活性，BBB通透性降低，VBE明顯緩解。隨后進(jìn)行了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)AKP、MAO在VBE模型上活性異常增高，應(yīng)用相應(yīng)單克隆抗體特異性抑制酶活性，發(fā)現(xiàn)BBB通透性降低，腦灰、白質(zhì)水分含量明顯下降，VBE減輕。Dogan等人通過阻礙多氨生物合成的鳥氨酸脫氫

7、酶活性發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性腦梗塞面積減少了22％左右，同時(shí)減少了腦水腫含量。因此對(duì)BBB中一些酶活性的改變與VBE的發(fā)生發(fā)展有了更深一步的認(rèn)識(shí)，酶活性增加，意味著物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)交換增加，也在一定程度上反映了BBB通透性的改變。由此認(rèn)為BBB中的酶學(xué)改變與VBE有密切聯(lián)系，對(duì)VBE的形成具有一定的作用。 AC存在于心、肝、腎、胸腺細(xì)胞、唾液腺和神經(jīng)組織，是多基因大家族，分為5組9族，屬膜結(jié)合酶。其生理功能是催化三磷酸腺苷(ATP)生成環(huán)磷酸腺苷(

8、cAMP)。AC直接參與cAMP的調(diào)節(jié)而影響cAMP在體內(nèi)的濃度。cAMP通過激活其他蛋白和酶類，控制離子通道的通透性來進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣的水平，并且在高等生物體內(nèi)復(fù)雜而精密的信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中作為第二信使，參與復(fù)雜的細(xì)胞間信息傳遞，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，故其在生理上是一種非常重要的化合物?？紤]AC是酶屏障組成的重要成分之一，在發(fā)生VBE時(shí)活性明顯增高，由此我們推測(cè)改變其活性可能影響VBE的病變基礎(chǔ)，降低BBB的通透性，特異性地減少腦

9、白質(zhì)水分，達(dá)到治療VBE的目的。 VBE的病理機(jī)制及其治療一直是一個(gè)備受關(guān)注的課題，如何建立理想的VBE模型又是進(jìn)一步研究的前提。目前國內(nèi)外大多采用缺血性、冷凍傷和創(chuàng)傷性模型進(jìn)行腦水腫的發(fā)病機(jī)制研究。這些方法為有創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)，易造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不精確，且可重復(fù)性差，加之制作的模型與經(jīng)典VBE概念有一定的距離，均不宜更好地研究VBE的發(fā)病機(jī)制與病理變化。 本研究旨在建立理想的VBE模型，從降低VBE模型中AC活性的角度出發(fā)，觀察其

10、對(duì)BBB及VBE的影響，進(jìn)一步確認(rèn)其在VBE發(fā)生中的作用，為臨床治療VBE提供有效、可行的方法及途徑。 材料和方法 1VBE模型的制備 40只Wistar大鼠。其中20隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射苯腎上腺素，參照cole等的方法測(cè)定腦毛細(xì)血管通透性；其余20只分組及處理同上，使用遠(yuǎn)紅外水分分析儀進(jìn)行腦水分含量測(cè)定。 2腺苷酸環(huán)化酶多克隆抗體對(duì)大鼠血管源性腦水腫保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究60只

11、Wistar大鼠，其中20只隨機(jī)分為正常組、腦水腫組、腦水腫甘露醇組與腦水腫腺苷酸環(huán)化酶多克隆抗體(Adenylatecyclasepolyclonalantibody,ACpAb)組，每組5只。剩余40只分組同上，每組10只。參照上述方法制成VBE模型。腦水腫甘露醇組與腦水腫ACpAb組造模后分別股靜脈注射20％甘露醇0.5g/kg、腹腔注射ACpAb1μg/kg。按上述方法測(cè)定腦毛細(xì)血管通透性及腦水分含量，組織化學(xué)染色后用圖像分析系

12、統(tǒng)定量測(cè)定AC活性。 結(jié)果 1VBE模型的制備 腦毛細(xì)血管通透性測(cè)定：對(duì)照組EB滲出量0.028±0.013OD/g；實(shí)驗(yàn)組0.076±0.0210D/g，兩組相比有顯著性差異(P＜0.01)。 腦水分含量測(cè)定：對(duì)照組腦灰、白質(zhì)水分含量百分比分別為68.596±1.719、65.522±1.816；實(shí)驗(yàn)組分別為75.628±1.398、77.053±2.384，對(duì)照組腦灰、白質(zhì)水分含量百分比與實(shí)驗(yàn)組相比均

13、有顯著性差異(P＜0.01)。 腦灰、白水分含量差值的測(cè)定結(jié)果：灰質(zhì)差值7.032±2.13，白質(zhì)差值11.531±2.16，兩者相比有顯著性差異(P＜0.01)。 2腺苷酸環(huán)化酶多克隆抗體對(duì)大鼠血管源性腦水腫保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究 腦毛細(xì)血管通透性測(cè)定：各組EB滲出量如下：正常組0.026±0.005OD/g；腦水腫組0.074±0.007OD/g；腦水腫甘露醇組0.063±0.003OD/g；腦水腫ACpAb組0

14、.043±0.006OD/g。腦水腫ACpAb組EB滲出量同腦水腫組及腦水腫甘露醇組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。 腦水分含量測(cè)定：正常組腦灰、白質(zhì)水分含量百分比分別為69.596±1.719、65.612±1.816；腦水腫組分別為76.628±1.398、77.447±2.384；腦水腫甘露醇組分別為72.689±1.901、73.629±1.110；腦水腫ACpAb組分別為73.797±0.552、69.777±1.

15、973。腦水腫甘露醇組、腦水腫ACpAb組灰、白質(zhì)水分含量百分比與腦水腫組相比有顯著性差異(P＜0.01)；腦水腫甘露醇組灰質(zhì)水分含量百分比與腦水腫ACpAb組相比無顯著性差異(P＞0.05)；但兩組間白質(zhì)水分含量百分比有顯著性差異(P＜0.01)。 AC組化染色結(jié)果：正常腦屏障毛細(xì)血管可見AC有一定水平的表達(dá)，腦水腫組AC活性明顯增高，應(yīng)用甘露醇后AC活性強(qiáng)度稍下降，應(yīng)用ACpAb后AC活性明顯下降。 圖像分析單位面積

16、光密度：正常組0.478±0.013OD/g，腦水腫組0.896±0.019OD/g，腦水腫甘露醇組0.863±0.048OD/g，腦水腫ACpAb組0.508±0.026OD/g。腦水腫甘露醇組同腦水腫組相比無顯著性差異(P＞0.05)，腦水腫ACpAb組同腦水腫組相比有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論 1.腹腔注射苯腎上腺素方法制成VBE模型，是以高血壓為VBE的誘發(fā)因素，符合臨床人類最多見的腦血管病發(fā)病情況，且該