IGF-1促進(jìn)人NK細(xì)胞發(fā)育及殺傷功能.pdf

1、自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells，NK cells)，作為與T細(xì)胞、B細(xì)胞并列的一大類淋巴細(xì)胞群體，是天然免疫系統(tǒng)的重要成員。NK細(xì)胞除了參與先天性免疫應(yīng)答之外，還在適應(yīng)性免疫的免疫調(diào)節(jié)中起著重要的調(diào)控作用。研究表明，NK細(xì)胞在病原微生物感染、腫瘤以及自身免疫病等多種病理過程中都發(fā)揮著重要的功能。然而，NK細(xì)胞的發(fā)育、分化以及功能的調(diào)節(jié)等研究領(lǐng)域還存在許多空白。因此，深入研究NK細(xì)胞發(fā)育及其功能的調(diào)控機制將具有重要

2、的意義。
　　 胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，其生物學(xué)功能非常廣泛，已經(jīng)有文獻(xiàn)報道IGF-1可以促進(jìn)T、B細(xì)胞的發(fā)育和生物學(xué)功能;但I(xiàn)GF-1在NK細(xì)胞發(fā)育及功能中有何作用卻鮮有報道。本課題主要研究IGF-1在人NK細(xì)胞發(fā)育及功能中的調(diào)控作用，并深入探討其機制，進(jìn)一步完善人NK細(xì)胞的基礎(chǔ)生物學(xué)理論，并為NK細(xì)胞的臨床生物治療提供堅實的實驗基礎(chǔ)。
　　 本課題

3、首先分離正常的新生兒臍帶血來源的CD34+造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSC)，加入干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)、Flt3配體(fms-like tyrosine kinase-3 ligand，F(xiàn)lt3L)和白介素-15(interleukin-15，IL-15)進(jìn)行長期培養(yǎng)（28天），進(jìn)行體外NK細(xì)胞的分化及擴增，通過在該體系中加入IGF-1，探討IGF-1對人NK細(xì)胞的發(fā)

4、育及功能的影響及相關(guān)分子機制;其次分離正常人早孕蛻膜NK細(xì)胞，體外用IGF-1刺激，進(jìn)一步闡明IGF-1對人NK細(xì)胞功能的影響及分子機制;此外，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)不同來源的NK細(xì)胞分泌不同水平的IGF-1，因此，利用IGF-1 siRNA及中和抗體阻斷實驗闡明內(nèi)源性IGF-1對NK細(xì)胞功能的影響;為了揭示不同來源NK細(xì)胞差異表達(dá)內(nèi)源性IGF-1的分子機制，我們利用microRNA芯片技術(shù)比較不同來源的NK細(xì)胞micmRNA表達(dá)譜差異，以篩

5、選調(diào)控NK細(xì)胞內(nèi)源性IGF-1表達(dá)的microRNA，并驗證目的microRNA通過靶向IGF-1調(diào)控NK細(xì)胞的功能。
　　 一、 IGF-1促進(jìn)人NK細(xì)胞發(fā)育。
　　 我們應(yīng)用體外人NK細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系，即體外分離純化新生兒臍帶血來源的CD34+造血干細(xì)胞，采用SCF、Flt3L、IL-15聯(lián)合細(xì)胞因子刺激CD34+HSC分化發(fā)育為NK細(xì)胞。通過在該體系中加入IGF-1，培養(yǎng)28天后收集細(xì)胞，計數(shù)，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)

6、檢測CD3℃D56+NK細(xì)胞的比例、表面受體分子的表達(dá)及其功能性指標(biāo)的表達(dá)變化，明確IGF-1在人NK細(xì)胞的發(fā)育及功能中的作用;通過檢測NK細(xì)胞發(fā)育過程中IRS-1的表達(dá)水平，初步闡明IGF-1促進(jìn)NK細(xì)胞發(fā)育的機制。
　　 結(jié)果顯示，當(dāng)在該體系中加入IGF-1后，NK細(xì)胞的比例和絕對數(shù)都有顯著提高;流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入IGF-1組發(fā)育分化的NK細(xì)胞殺傷相關(guān)分子如穿孔素的表達(dá)上調(diào)，脫顆粒的能力上調(diào)（CD107a表達(dá)上調(diào)）。

7、
　　 此外，我們發(fā)現(xiàn)在體外NK細(xì)胞發(fā)育過程的第14天，即NK細(xì)胞前體出現(xiàn)的時間，細(xì)胞不表達(dá)IRS-1，而在發(fā)育過程的第21天，細(xì)胞則表達(dá)IRS-1。鑒于IRS-1在IGF-1信號傳遞中的作用，我們得出以下結(jié)論:在IGF-1促進(jìn)NK細(xì)胞發(fā)育的過程中，IGF-1可能起雙重作用，即IGF-1先促進(jìn)NK細(xì)胞前體的分化，之后則促進(jìn)分化后NK細(xì)胞的增殖。
　　 綜上結(jié)果，我們得出如下結(jié)論:IGF-1可以促進(jìn)人NK細(xì)胞發(fā)育，且有可能

8、提高NK細(xì)胞的殺傷潛能。
　　 二、 IGF-1促進(jìn)入NK細(xì)胞殺傷功能。
　　 為了進(jìn)一步驗證IGF-1對人NK細(xì)胞殺傷功能的影響，我們首先收集正常人早孕蛻膜組織，分離純化蛻膜NK細(xì)胞，體外用IGF-1刺激培養(yǎng)24 h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞穿孔素perforin及CD107a的表達(dá);51Cr釋放實驗檢測NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性（殺傷功能）的變化。同時，我們對IGF-1刺激NK細(xì)胞后胞內(nèi)信號分子進(jìn)行了初步檢測，以進(jìn)一步闡

9、明IGF-1促進(jìn)人NK細(xì)胞殺傷功能的相關(guān)分子機制。
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，當(dāng)IGF-1刺激早孕蛻膜NK細(xì)胞后，NK細(xì)胞perforin及CD107a表達(dá)均顯著上調(diào)，51Cr釋放實驗結(jié)果顯示，IGF-1刺激蛻膜NK細(xì)胞后其細(xì)胞毒活性（殺傷功能）也有顯著提高。
　　 此外，我們發(fā)現(xiàn)IGF-1可以促進(jìn)NK細(xì)胞中STAT3的磷酸化，而且STAT3的抑制劑在抑制STAT3活化的同時，也抑制了NK細(xì)胞perforin的表達(dá)，

10、這表明IGF-1促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷功能的機制，可能是通過STAT3信號途徑啟動了perforin的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其更強的細(xì)胞毒活性。
　　 根據(jù)這部分結(jié)果我們得出如下結(jié)論:IGF-1可以促進(jìn)人NK細(xì)胞的殺傷功能。
　　 三、內(nèi)源性IGF-1對NK細(xì)胞的殺傷功能至關(guān)重要。
　　 在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)不同來源的NK細(xì)胞，如正常人外周血NK(pNK)細(xì)胞及早孕蛻膜組織中的NK(dNK)細(xì)胞均可分泌IGF-1，且分泌水平

11、存在差異。鑒于不同來源的NK細(xì)胞其殺傷功能存在差異，因此我們推測內(nèi)源性IGF-1可能參與NK細(xì)胞殺傷功能的調(diào)控。為了進(jìn)一步驗證內(nèi)源性IGF-1在人NK細(xì)胞殺傷功能中的重要調(diào)控作用，我們利用核轉(zhuǎn)染技術(shù)將IGF-1 siRNA轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞系，qRT-PCR檢測perforin等殺傷相關(guān)基因的表達(dá)變化;利用IGF-1中和抗體處理人外周血NK細(xì)胞，51Cr釋放實驗檢測NK細(xì)胞殺傷功能的變化。
　　 結(jié)果顯示，當(dāng)IGF-1 siRNA轉(zhuǎn)染

12、NK細(xì)胞系后，NK細(xì)胞perforin表達(dá)下調(diào);51Cr釋放實驗結(jié)果顯示:當(dāng)IGF-1中和抗體處理外周血NK細(xì)胞后，NK細(xì)胞的殺傷功能顯著降低。此外，我們發(fā)現(xiàn)臨床上反復(fù)流產(chǎn)病人的早孕蛻膜NK(dNK)細(xì)胞較正常人早孕蛻膜NK(dNK)細(xì)胞表達(dá)較高的內(nèi)源性IGF-1，這與它們的殺傷能力呈正相關(guān)趨勢。
　　 綜上結(jié)果我們得出如下結(jié)論:內(nèi)源性IGF-1對NK細(xì)胞的殺傷功能至關(guān)重要。
　　 四、 miR-483-3p靶向IGF-

13、1調(diào)控人NK細(xì)胞的殺傷功能。
　　 為了揭示不同來源NK細(xì)胞差異表達(dá)內(nèi)源性IGF-1的分子機制，我們采用microRNA芯片技術(shù)，比較不同來源的NK細(xì)胞(dNK，cNK，pNK)以及外周血來源的NKT和T細(xì)胞之間microRNA的表達(dá)譜差異;利用靶基因預(yù)測網(wǎng)站分析與IGF-1相互作用的microRNA;利用分子克隆方法構(gòu)建IGF-13UTR雙熒光素酶報告載體并鑒定，之后進(jìn)行雙熒光素酶報告基因檢測方法驗證microRNA與靶基因相

14、互作用;利用microRNA模擬體mimic和抑制劑inhibitor，并結(jié)合IGF-1中和抗體闡明microRNA通過靶向IGF-1調(diào)控人NK細(xì)胞的殺傷功能。
　　 microRNA芯片檢測結(jié)果顯示，不同來源的人NK細(xì)胞其microRNA表達(dá)譜有著顯著的差異;此外我們篩選到7個在NK細(xì)胞中特異表達(dá)的microRNAs:miR-340*,miR-483-3p,miR-130a, miR-199b-5p,miR-199a-3p,m

15、iR-210和miR-362-5p。其中miR-483-3p在早孕蛻膜NK(decidual NK，dNK)細(xì)胞中特異性高表達(dá)，利用Targetscan等預(yù)測網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)IGF-1為其潛在相互作用的靶基因;接下來，我們成功構(gòu)建了分別包含IGF-1野生型3'UTR及突變型3'UTR的雙熒光素酶報告基因載體，并采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證miR-483-3p可與預(yù)測靶基因IGF-1相互作用。我們迸一步采用miR-483-3p mimic

16、核轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞，上調(diào)NK細(xì)胞中miR-483-3p的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞殺傷能力減弱;相反，用miR-483-3p inhibitor核轉(zhuǎn)染dNK細(xì)胞，下調(diào)dNK細(xì)胞中hsa-miR-483-3p的表達(dá)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)dNK細(xì)胞殺傷能力顯著增強，并且IGF-1中和抗體可以逆轉(zhuǎn)miR-483-3p inhibitor對NK殺傷功能的影響。這表明miR-483-3p通過直接靶向NK細(xì)胞內(nèi)源性IGF-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞的殺傷功能。

17、>　　 綜合以上，本課題的研究發(fā)現(xiàn)了生長因子IGF-1在人NK細(xì)胞中的新功能，即IGF-1可以促進(jìn)人NK細(xì)胞的發(fā)育和細(xì)胞毒活性（殺傷功能），并深入闡述了其中的詳細(xì)機制。此外，我們發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的內(nèi)源性IGF-1的表達(dá)對NK細(xì)胞的殺傷功能至關(guān)重要;不同來源的NK細(xì)胞殺傷功能的差異可能來自于其內(nèi)源性IGF-1的差異表達(dá)，NK細(xì)胞IGF-1的差異表達(dá)受miR-483-3p的調(diào)控，即miR-483-3p可以通過靶向IGF-1調(diào)控NK細(xì)胞的殺傷功