中藥附子反相高效液相和RAPD指紋圖譜及質(zhì)量評價研究.pdf

1、附子為毛莨科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)的旁生塊根(子根)，是我國常用中藥材品種之一，附子具有強心、提高免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛及抗衰老等藥理作用。本文研究了中藥附子中有效成分的提取，對其成分的高效液相色譜分離條件進行了優(yōu)化，建立了附子鮮品及飲片的反相高效液相色譜指紋圖譜，在鮮品指紋圖譜基礎(chǔ)上對不同產(chǎn)地的附子中有效成分含量進行了比較，同時對附子的RAPD指紋圖譜進行了初步研究。

2、 實驗取得的主要研究結(jié)果如下： 1、比較了乙醚-氨水、氯仿、無水乙醇體系對附子中三種主要生物堿：烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的提取效率，并比較了冷浸、超聲二種方式提取三種生物堿的提取效率，在此基礎(chǔ)上確定了提取方式和最佳提取時間。最終確定的提取條件為乙醚：氨水(20∶1，V/V)溶液超聲提取20min。 2、比較了甲醇-水、乙腈-水體系對附子提取液的分離效果，并采用反相高效液相色譜(RPLC)多臺階梯度優(yōu)化方法對附子提取液

3、的色譜分離條件進行優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化最終確定的色譜條件對附子提取液進行分離得到20個分離效果良好的色譜峰；用試驗對此優(yōu)化條件的穩(wěn)定性、精密度等進行了驗證，試驗結(jié)果顯示了較好的預測精度和分離度。本方法分離附子提取液的分析時間短且分離度高，顯示了臺階梯度優(yōu)化方法在確定色譜分離條件上的優(yōu)越性。 3、用一種新的多臺階梯度洗脫系統(tǒng)的RPLC法，首次建立了陜西漢中、四川江油、安縣、云南、貴州不同產(chǎn)地產(chǎn)附子藥材的由10種成分組成的色譜指紋圖譜。以烏

4、頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿為參照峰作為相對標準，對其質(zhì)量進行了評估。研究了漢中四種不同種質(zhì)來源的附子指紋圖譜差異，還提出用相對含量比較法對不同來源附子中10種成分的含量進行了質(zhì)量評價。本文所建立的附子藥材的RPLC指紋圖譜方法，從試樣提取的精密度、穩(wěn)定性、圖譜重復性等方面均符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》中的有關(guān)規(guī)定。該方法具有重現(xiàn)性好，特征性強，方法簡便、快速等特點，有可能成為附子藥材種屬判斷、質(zhì)量評估的標準。

5、4、在建立可靠的附子藥源植物烏頭基因組DNA提取分離和RAPD-PCR擴增技術(shù)體系的基礎(chǔ)上篩選具有穩(wěn)定的多態(tài)性的RAPD引物。利用RAPD標記檢測4個地方類群的附子藥源植物的DNA遺傳多態(tài)性，構(gòu)建附子藥源植物的DNA指紋圖譜。篩選的引物擴增條帶清晰并具有5～16個多態(tài)性位點。利用瓊脂糖凝膠電泳可以便捷地檢測擴增的DNA多態(tài)性。從11條RAPD隨機引物中篩選出3條RAPD引物，確定了120多個多態(tài)性位點，對四個類群的附子藥源植物進行了RA