外周絲裂原活化蛋白激酶在蜜蜂毒肽誘致病理性痛中的作用.pdf

1、在過去的10年中，本研究組在LariviereandMelzack提出蜜蜂毒（Beevenom，BV）模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行了更進(jìn)一步的研究。該模型的特點(diǎn)是可以模擬臨床病理性痛的三大表現(xiàn)，包括：1）持續(xù)性自發(fā)痛，2）原發(fā)性熱痛敏和機(jī)械痛敏，3）繼發(fā)性痛敏和“鏡像痛敏”。同時(shí)本研究組還應(yīng)用在體電生理單細(xì)胞胞外記錄技術(shù)，在蜜蜂毒足底注射側(cè)脊髓背角相應(yīng)節(jié)段誘導(dǎo)出脊髓背角廣動(dòng)力域（wide-dynamic-range，WDR）神經(jīng)元自發(fā)放電反應(yīng)增強(qiáng)及

2、對(duì)注射部位熱和機(jī)械刺激反應(yīng)增強(qiáng)現(xiàn)象，其持續(xù)時(shí)程和反應(yīng)形式與行為學(xué)的結(jié)果一致。隨后本研究組還對(duì)蜜蜂毒成分進(jìn)行了深入研究，蜜蜂毒是含有二十余種成分的復(fù)合物，其主要成分包括：（1）蜜蜂毒肽（Melittin），是蜜蜂粗毒中最主要（在凍干的粗毒中占50％左右）的物質(zhì)成分；（2）蜂毒明肽（Apamin），在凍干的粗毒中僅占2％；（3）其他主要致傷害成分，如磷脂酶A2（12％）、透明脂酸酶（小于3％）、肥大細(xì)胞脫顆粒肽（2％）、組胺（1.5％）、M

3、elittinF等。因?yàn)橐延袌?bào)道稱皮下分別注射磷脂酶A2、透明脂酸酶、肥大細(xì)胞脫顆粒肽、組胺和5-HT等化學(xué)物質(zhì)不能引起像蜜蜂毒和福爾馬林那樣的長時(shí)程持續(xù)自發(fā)縮足反射行為，而且也不能長時(shí)程激活外周初級(jí)傳入C纖維和脊髓背角傷害性神經(jīng)元持續(xù)放電增強(qiáng)，所以推測(cè)這些物質(zhì)不是蜜蜂毒中主要致炎致痛成分。我們還應(yīng)用行為藥理學(xué)、在體單細(xì)胞胞外記錄、離體單細(xì)胞全細(xì)胞膜片鉗記錄以及鈣成像等技術(shù)對(duì)蜜蜂毒肽的生物學(xué)作用及機(jī)制進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)蜜蜂毒肽（Meli

4、ttin）是蜜蜂毒中主要的致炎致痛化學(xué)成分，是蜜蜂毒誘發(fā)持續(xù)性自發(fā)痛、熱和機(jī)械痛敏以及炎癥反應(yīng)的主要因素。它可以直接敏化外周初級(jí)感覺神經(jīng)元，開放細(xì)胞上辣椒素受體的非選擇性陽離子通道（transientreceptorpotentialvanilloid1，TRPV1），從而介導(dǎo)蜜蜂毒肽誘致的持續(xù)性自發(fā)痛和熱痛敏以及脊髓背角傷害性神經(jīng)元的功能改變，還可以通過激活磷脂酶A2－脂氧合酶代謝途徑并在胞內(nèi)蛋白激酶A、C的協(xié)助下調(diào)節(jié)TRPV1的開放

5、從而引起皮下注射蜜蜂毒肽后行為學(xué)上表現(xiàn)的持續(xù)性自發(fā)痛和熱痛敏等，并且已有人體實(shí)驗(yàn)證明蜜蜂毒肽可以引起自發(fā)痛和原發(fā)性機(jī)械痛敏。
　　然而蜜蜂毒肽引起的多種痛相關(guān)行為的外周傳入機(jī)制還未完全清楚地描述。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activedproteinkinases,MAPKs）作為一類在進(jìn)化中高度保守的蛋白激酶，參與了細(xì)胞內(nèi)部許多方面的調(diào)節(jié)，它通過將胞外刺激轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯后反應(yīng)，從而將細(xì)胞表面的受體同胞內(nèi)關(guān)鍵的調(diào)

6、節(jié)目標(biāo)聯(lián)系起來，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。
　　在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，有三個(gè)MAPK家族成員已經(jīng)得到比較清楚的描述，即ERK1/2（extracellularsignal-regulatedkinase1and2），c-JunN末端激酶/應(yīng)激激活的蛋白激酶（JNK/SAPK，c-JunN-terminalkinase/stress-activedproteinkinase）和p38激酶。其中ERK、JNK以及P38絲裂原活化

7、蛋白激酶在蜂毒肽引起的傷害性刺激反應(yīng)以及痛敏中是否發(fā)揮了作用？其ERK、JNK、P38的作用是否一致？當(dāng)前的研究能否幫我們進(jìn)一步闡述蜂毒肽引起的多種痛相關(guān)行為的外周傳入機(jī)制？于是我們展開了外周絲裂原活化蛋白激酶在蜜蜂毒肽誘致的病理性痛中作用的相關(guān)研究。實(shí)驗(yàn)方法主要是在大鼠后足底皮下局部注射蜜蜂毒肽引起的炎癥反應(yīng)部位先后分別注射細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellularsignal-regulatedkinase，ERK）抑制劑U01

8、26、c-Jun氨基末端激酶（C-JunN-terminalkinase，JNK）抑制劑SP600125以及P38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑SB239063，通過行為藥理學(xué)的方法觀察它們?cè)诿鄯涠倦恼T致的病理性痛中的作用。
　　結(jié)果：（1）在未進(jìn)行任何處理的大鼠后足皮下注射ERK、JNK、P38抑制劑不能改變大鼠對(duì)熱反應(yīng)的潛伏期和對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)閾值，這提示在正常生理狀態(tài)下，這三個(gè)主要外周絲裂原活化蛋白激酶亞家族成員在正常痛感覺傳遞過

9、程中作用較小。（2）通過前給藥方式ERK、JNK及P38抑制劑能明顯的抑制蜂毒肽誘發(fā)的持續(xù)性自發(fā)痛的產(chǎn)生，并呈劑量依賴性；通過后給藥的方式也能明顯的抑制蜂毒肽誘發(fā)的持續(xù)性自發(fā)痛的維持。（3）對(duì)于熱痛敏，在前給藥組中，ERK、JNK、P38抑制劑均能抑制蜂毒肽誘發(fā)原發(fā)性熱痛敏的產(chǎn)生；且在后給藥組中于蜂毒肽皮下注射2到3小時(shí)后分別在同側(cè)皮下注射ERK、JNK、P38抑制劑也能部分逆轉(zhuǎn)熱痛敏，說明這三種蛋白激酶在蜂毒肽誘發(fā)原發(fā)性熱痛敏產(chǎn)生和維

10、持的過程中發(fā)揮了作用。（4）對(duì)于機(jī)械性痛敏，無論是通過前給藥方式還是通過后給藥方式，ERK與JNK抑制劑對(duì)蜂毒肽誘發(fā)原發(fā)性機(jī)械痛敏無抑制作用，說明這兩種蛋白激酶并未參與蜂毒肽誘發(fā)原發(fā)性機(jī)械痛敏的產(chǎn)生與維持；而P38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑對(duì)原發(fā)性機(jī)械痛敏的產(chǎn)生無抑制作用，對(duì)原發(fā)性機(jī)械痛敏的維持有部分抑制作用。（5）在對(duì)側(cè)足底局部注射這三種激酶抑制劑，對(duì)注射蜂毒肽一側(cè)足底的持續(xù)性自發(fā)痛、原發(fā)性熱和機(jī)械痛敏的產(chǎn)生和維持也無影響，這樣就排除了