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文檔簡介
1、第一部分:BDNF對骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANKL的影響和機制研究
目的:體外實驗探討MM細(xì)胞分泌的BDNF對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌RANKL的影響和相關(guān)信號通路
方法:分離培養(yǎng)正常人的原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進行鑒定;在體外應(yīng)用人重組BDNF刺激人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,RT-PCR或WesternBlot法檢測BDNF對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌RANKL的影響;加入BDNF高親和力受體TrkB的拮抗劑K252a,ELISA法檢測K
2、252a對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌RANKL的影響;WesternBlot法檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)ERK、AKT和I-kB的磷酸化水平,免疫熒光法檢測NF-kBp65亞基的核轉(zhuǎn)位情況;利用0.4μmTranswell構(gòu)建MM-BMSCs兩系共培養(yǎng)和MM-BMSCs-preOC三系共培養(yǎng)體系,并以K252a進行干預(yù),檢測MM細(xì)胞分泌的BDNF對兩系和三系共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞形成的影響。
結(jié)果:人間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD44、CD105和
3、CD29,不表達(dá)CD14,CD45,通過成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)能向成骨細(xì)胞定向分化;人重組BDNF能在mRNA水平和蛋白水平促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)RANKL的表達(dá),這種作用具有時間和劑量依賴性,而且能被K252a部分拮抗;25ng/mlBDNF刺激人間充質(zhì)干細(xì)胞5min后,能檢測到磷酸化ERK水平的升高,15min達(dá)到峰值;同濃度BDNF作用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5min后磷酸化的AKT水平顯著增加;BDNF對人間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)I-kB水平和p
4、65亞基的核轉(zhuǎn)位沒有明顯影響;ERK抑制劑U0126能顯著阻斷BDNF對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌RANKL的促進作用,AKT抑制劑LY204002對RANKL的分泌也存在抑制,但是這種作用不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.069),提示MEK/ERK是BDNF促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌RANKL的主要調(diào)控通路。人間充質(zhì)干細(xì)胞與MM細(xì)胞系和原代MM細(xì)胞共培養(yǎng)能促進RANKLmRNA的表達(dá),K252a能部分抑制這種促進作用;當(dāng)preOC與多種MM細(xì)胞
5、共培養(yǎng)或者preOC與MM細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞三系共培養(yǎng)時,破骨細(xì)胞的數(shù)目均有顯著增加;BDNF的中和性抗體能部分抑制這種上調(diào)作用,OPG則能完全拮抗該作用。
結(jié)論:人重組BDNF能促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)RANKL的表達(dá);這種作用可能是通過MEK/ERK信號通路實現(xiàn)的;在兩系和三系共培養(yǎng)體系中,MM細(xì)胞通過分泌BDNF能促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)RANKL的表達(dá)和破骨細(xì)胞形成。
第二部分:基因沉默骨髓瘤細(xì)胞BDNF的表達(dá)
6、抑制小鼠骨髓瘤模型的骨質(zhì)破壞和腫瘤生長
目的:通過慢病毒shRNA載體下調(diào)BDNF在骨髓瘤細(xì)胞系A(chǔ)RH77和RPMI8226的表達(dá),建立SCID-rab-ARH77和SCID-RPMI8226小鼠人骨髓瘤模型,在體內(nèi)實驗中研究基因沉默BDNF對骨髓瘤骨質(zhì)破壞和腫瘤負(fù)荷的影響及可能機制。
方法:構(gòu)建能反向抑制BDNF的shRNA序列,利用慢病毒載體將其轉(zhuǎn)染至骨髓瘤ARH77和RPMI8226細(xì)胞,流式細(xì)胞分選術(shù)篩選出e
7、GFP陽性、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BDNFshRNA的細(xì)胞群,使用WesternBlot法驗證該shRNA載體對BDNF的基因沉默作用;構(gòu)建SCID-rab-ARH77模型時,將新鮮兔骨移植至NOD/SCID小鼠皮下,待移植骨存活后,將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BDNFshRNA的ARH77細(xì)胞(AS組)注射至小鼠皮下兔骨的骨髓腔;構(gòu)建SCID-RPMI8226模型時,將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了BDNFshRNA的RPMI8226細(xì)胞(AS組)直接通過尾靜脈注射入SCID小鼠體內(nèi),
8、并以非特異性序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空載體組(EV組);小動物熒光活體成像實驗連續(xù)監(jiān)測骨髓瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長情況,觀察總體存活時間,按Kaplan-Meier法繪制生存曲線,用Log-rank檢驗比較生存率;X線和骨密度檢測觀察荷瘤小鼠的骨質(zhì)損害情況;H&E染色觀察腫瘤浸潤和骨質(zhì)破壞情況;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測骨髓切片破骨細(xì)胞的密度;免疫組化、WesternBlot和ELISA方法檢測動物模型體內(nèi)中BDNF和RANKL的含量;<
9、br> 結(jié)果:SCID-rab-ARH77模型小鼠的骨骼X線拍攝顯示,低表達(dá)內(nèi)源性BDNF的AS組小鼠,其皮下兔骨的溶骨性損害程度明顯低于EV組(每組12只,P=0.02);H&E染色顯示AS組骨片具有相對正常的骨結(jié)構(gòu)和連續(xù)的骨皮質(zhì),而EV組的兔骨正常結(jié)構(gòu)被破壞、骨小梁被吸收、腫瘤突破骨皮質(zhì);相對于接種MM細(xì)胞前,EV組的BMD降低68%±5%,而AS組BMD僅下降15%±8%(P<0.05);TRAP染色顯示AS組骨片的破骨細(xì)胞密度
10、顯著低于EV組(P<0.01);接種了AS-ARH細(xì)胞的兔骨,其髓漿內(nèi)BDNF和RANKL濃度明顯低于EV組(P<0.01);在腫瘤負(fù)荷方面,AS組小鼠外周血循環(huán)中的人IgG含量明顯低于EV組(n=12,P<0.05),總體生存期較EV組顯著延長(P<0.05)。類似地,在SCID小鼠經(jīng)尾靜脈注射MM細(xì)胞的骨髓瘤模型,我們發(fā)現(xiàn),與EV組相比,低表達(dá)內(nèi)源性BDNF的AS組小鼠其骨質(zhì)破壞程度低、腫瘤負(fù)荷和血管新生水平低、生存期延長。
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