鈣激活中性蛋白酶作為抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移靶點的效用研究.pdf

1、目的: 觀察Calpain的相關(guān)抑制劑對不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞遷移浸潤能力和肝癌細(xì)胞信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)及活性的影響，進一步認(rèn)識肝癌轉(zhuǎn)移分子機制，為臨床防治肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提供依據(jù)。
　　方法: （1）用Western blot檢測3株不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞（MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2）和1株正常肝細(xì)胞（HL-7702）中Calpain-1及Calpain-2表達(dá)，篩選與肝癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的Calpain的亞家族成員；（2

2、）用ALLM、Calpain inhibitor IV、Calpain inhibitor VI、Calpastatin四種Calpain抑制劑，分別給予高、中、低三種濃度預(yù)處理MHCC97-H肝癌細(xì)胞24h、48h及72h，用Western blot方法觀察Calpain-2的表達(dá)及剪切活性，選擇4種抑制劑的最適濃度和作用時間；(3)用4種抑制劑的最適濃度和作用時間處理肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞，觀察4種抑制劑對肝癌細(xì)胞信號通路相關(guān)蛋白 S

3、rc、FAK、及 Dicer的表達(dá)，通過劃痕實驗檢測對細(xì)胞遷移能力的影響，Transwell實驗檢測對細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　結(jié)果: (1)與正常肝細(xì)胞HL-7702相比，Calpain-1在4種肝細(xì)胞中表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），Calpain-2在3種肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)（P<0.05）,有轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞中Calpain-2的表達(dá)上調(diào)（P<0.01）。(2)4種高濃度Calpain-2抑制劑（ALLM、Calpain

4、 inhibitor IV、Calpain inhibitor VI、Calpastatin）分別處理 MHCC97-H細(xì)胞72 h，都使Calpain-2的表達(dá)下調(diào)（P<0.05或P<0.01）。(3)高濃度ALLM和Calpain inhibitor VI處理3種肝癌細(xì)胞和1種正常肝細(xì)胞72h后，與正常肝細(xì)胞相比，具有轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞MHCC97-H和MHCC97-L中SRC、FAK表達(dá)上調(diào)（P<0.01），Dicer的表達(dá)下調(diào)（P

5、<0.01）；無轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞HepG2中SRC、FAK表達(dá)增高不明顯，（P>0.05），Dicer的表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。高濃度 Calpain inhibitor IV和Calpastatin處理3種肝癌細(xì)胞和1種正常肝細(xì)胞72h后，與未加抑制劑組相比，具有轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞的SRC、FAK的表達(dá)下調(diào)（P<0.01），無轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞HepG2中SRC、FAK表達(dá)下調(diào)不明顯（P>0.05），Dicer的表達(dá)上調(diào)（P<0.0

6、1）。(4)劃痕實驗結(jié)果顯示，高濃度ALLM和Calpain inhibitor VI處理3種肝癌細(xì)胞和1種正常肝細(xì)胞72h后，與0h相比，高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞MHCC97-H的遷移能力減弱（P<0.05）；高濃度Calpain inhibitor IV和Calpastatin處理種肝癌細(xì)胞和1種正常肝細(xì)胞72h后，與0h相比，3種不同轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞（MHCC97-H、HepG2、MHCC97-L）遷移能力都減弱（P<0.01或P<0.

7、05）。(5)侵襲實驗結(jié)果顯示，高濃度ALLM和Calpain inhibitor VI處理3種肝癌細(xì)胞和1種正常肝細(xì)胞72h后，4種細(xì)胞的侵襲能力無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），而高濃度Calpain inhibitor IV和Calpastatin處理3種肝癌細(xì)胞和1種正常肝細(xì)胞72h后，3種肝癌細(xì)胞侵襲能力下降（P<0.01）。
　　結(jié)論: (1)Calpain-2在3種肝癌細(xì)胞中高表達(dá)及有轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞中表達(dá)程度更高，提示