PTD-HBcAg融合蛋白誘導(dǎo)特異性CTL抑制HBV復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種非細(xì)胞病變性的具有包膜的雙鏈DNA病毒，其感染肝細(xì)胞引發(fā)的急、慢性肝炎是人體免疫系統(tǒng)在清除HBV感染的過(guò)程中對(duì)肝細(xì)胞破壞的結(jié)果。在免疫系統(tǒng)清除肝細(xì)胞中HBV時(shí)，起核心作用的是HBV特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，活化的CTL通過(guò)兩條途徑清除病毒：胞溶途徑—分泌穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒分子直接殺傷病毒感染的靶細(xì)胞或者Fas/Fas

2、L途徑介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，非胞溶途徑—分泌細(xì)胞因子抑制病毒復(fù)制。對(duì)于肽疫苗而言，如何將外源性抗原肽有效導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)內(nèi)主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)-I類抗原提呈途徑是激發(fā)特異性CTL應(yīng)答的關(guān)鍵。被MHC-I類分子提呈的抗原肽大多數(shù)來(lái)源于胞漿中合成的蛋白，所以理論上，若促進(jìn)外源性抗原肽進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞(APC)胞漿，

3、則可望相應(yīng)增強(qiáng)抗原肽被MHC-I類分子提呈的效率。近來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)有些蛋白具有很強(qiáng)的不依賴于受體的跨膜活性，這類具有跨膜活性的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域短肽稱為細(xì)胞穿膜肽或穿透肽(cell penetrating peptide，CPP)。目前研究最為透徹應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞穿透肽是HIV-Tat(human immunodeficiericy virustransactivator of transcription)蛋白；PTD(protein trans

4、duc-tion domain)是Tat蛋白行使跨膜功能的核心片段，包含該區(qū)段的蛋白具備穿透細(xì)胞膜的功能。盡管穿透肽的跨膜機(jī)制還不明確，但大量試驗(yàn)已證實(shí)它是一種很有前景的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)工具。諸多研究證實(shí)，PTD及其衍生體能夠有效穿透細(xì)胞膜，高效攜帶外源性抗原進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞亞定位，通過(guò)MHC-I類分子途徑提呈，誘導(dǎo)特異性CTL，從而發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒作用。通過(guò)構(gòu)建表達(dá)與細(xì)胞穿透肽融合的重組蛋白，可以在體內(nèi)外將不同蛋白和多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)入多種細(xì)胞

5、。本研究以前期構(gòu)建PTD-HBcAg融合基因質(zhì)粒為基礎(chǔ)，利用PTD-HBcAg融合蛋白體外刺激樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)成熟并誘導(dǎo)特異性CTL，體內(nèi)免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，對(duì)PTD-HBcAg融合蛋白誘導(dǎo)特異性CTL抑制HBV復(fù)制的免疫功能進(jìn)行了探討。 實(shí)驗(yàn)共分三部分：(1)PTD-HBcAg融合蛋白體外誘導(dǎo)小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞成熟及在T淋巴細(xì)胞增殖中的作用；(2)PTD-HBcAg融合蛋白誘導(dǎo)特異性CTL反

6、應(yīng)抑制HBV復(fù)制的體外研究；(3)PTD-HBcAg融合蛋白誘導(dǎo)特異性CTL抑制轉(zhuǎn)基因小鼠HBV復(fù)制的研究。 第一部分 PTD-HBcAg融合蛋白體外誘導(dǎo)小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞成熟及在T淋巴細(xì)胞增殖中的作用 目的：觀察融合蛋白PTD-HBcAg誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞成熟及對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的作用。 方法：體外分離培養(yǎng)近交系Balb/c小鼠髓源性DC，加重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granuloc

7、yte-macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF)、重組白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4培養(yǎng)5 d，再加入腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、HBcAg和PTD-HBcAg誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光在細(xì)胞中的分布及定位，流式細(xì)胞儀測(cè)定樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子表達(dá)，ELISA法測(cè)定樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12p70的水平，C

8、ell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。 結(jié)果：體外成功誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞，HBcAg主要定位于樹(shù)突狀細(xì)胞膜表面而PTD-HBcAg能夠穿透樹(shù)突狀細(xì)胞膜表面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。PTD-HBcAg能明顯上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子CD80、CD86和MHC-II類分子表達(dá)；50μ g/ml和100μ g/ml PTD-HBcAg誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12p70水平分別為

9、142.5±18.31 pg/ml和124.3±15.12 pg/ml，明顯高于50μ g/ml HBcAg組(42.31±4.213 pg/ml，t=9.2342和9.0448，p<0.05)；PTD-HBcAg誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖能力明顯高于HBcAg組及陽(yáng)性對(duì)照TNF-α組。 結(jié)論：PTD-HBcAg具有穿透樹(shù)突狀細(xì)胞膜能力并促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞分化、成熟，明顯上調(diào)表面共刺激分子表達(dá)，增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖及分泌I

10、L-12p70能力。 第二部分 PTD—HBcAg融合蛋白誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)抑制HBV復(fù)制的體外研究 目的：探討經(jīng)PTD-HBcAg融合蛋白致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)對(duì)HBV的抑制作用。 方法：體外分離培養(yǎng)小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞，加入不同融合蛋白刺激樹(shù)突狀細(xì)胞成熟后與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，ELISA法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞上清中IL-2、IL-4、IL-10和干擾素(interferon，IN

11、F)-γ的分泌水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子水平，乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗(yàn)檢測(cè)特異性CTL活性，并對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg及HBV DNA水平進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：經(jīng)不同融合蛋白刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞能有效促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，同時(shí)融合蛋白PTD-HBcAg組中IL-2(552.7±117.5 pg/ml)和INF-γ(150.6±7.945 pg/ml)明顯高于HBcAg組中IL-2(420±12.4

12、7 pg/ml)和INF-γ(107.5±12.19 pg/ml)分泌。流式細(xì)胞儀檢測(cè)PTD-HBcAg融合蛋白誘導(dǎo)的CTL水平明顯高于對(duì)照組。經(jīng)PTD-HBcAg融合蛋白組誘導(dǎo)的CTL比HBcAg誘導(dǎo)的CTL有明顯的特異性殺傷作用，同時(shí)對(duì)HBsAg及HBV DNA水平有明顯的抑制作用。 結(jié)論：經(jīng)PTD-HBcAg融合蛋白致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞能有效刺激T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及增加CTLs的表達(dá)，并增強(qiáng)特異性CTL活性及對(duì)HepG2.

13、2.15細(xì)胞上清中HBsAg及HBV DNA水平的抑制。 第三部分 PTD—HBcAg融合蛋白誘導(dǎo)特異性CTL抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠病毒復(fù)制的研究 目的：探討PTD-HBcAg融合蛋白體內(nèi)誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBV病毒的抑制作用。 方法：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分組，融合蛋白PTD-HBcAg及對(duì)照蛋白HBcAg經(jīng)皮下免疫小鼠，每周一次共三次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾細(xì)胞中胞內(nèi)細(xì)胞因子水平、

14、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中乙肝表面抗原(HBsAg)水平、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)HBV DNA水平。肝臟HE染色及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HBsAg表達(dá)。 結(jié)果：PTD-HBcAg融合蛋白免疫轉(zhuǎn)基因小鼠后，能有效上調(diào)特異性CTL數(shù)量，肝組織中炎性細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，同時(shí)對(duì)小鼠血清中HBsAg及HBV DNA水平有明顯的抑制作用。肝組織HBsAg免疫組織化學(xué)蛋白平均吸光度分析顯示，50μ g和100μ g PT

15、D-HBcAg融合蛋白組中平均吸光度值分別為128.28±0.98和117.31±1.21，明顯低于空白組和50μ g HBcAg組的154.44±3.12和135.66±1.89，F(xiàn)=50.77，p<0.05，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：PTD-HBcAg融合蛋白免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠后能增加特異性CTIL數(shù)量，顯著降低血清中HBsAg及HBV DNA水平，同時(shí)抑制肝臟中HBsAg的表達(dá)，在HBV免疫治療中具有抗病毒作用。