單鏈二硫鍵穩(wěn)定抗體靶向超抗原SEA（D227A）分子的構(gòu)建與活性研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(HCC)，簡稱肝癌，是惡性程度極高的惡性腫瘤，素有“癌王”之稱，目前臨床對肝癌的診治仍然十分困難，仍以手術(shù)治療和放化療為主。近年來，以抗體為基礎(chǔ)的導(dǎo)向治療方法的研究為腫瘤的診治帶來了生機(jī)，先后出現(xiàn)了以單鏈抗體、二硫鍵抗體、Fab抗體等抗體形式為導(dǎo)向載體，以細(xì)胞因子、毒素分子、超抗原、放射性核素為“彈頭”的導(dǎo)向治療制劑。 在單鏈抗體、二硫鍵抗體、Fab抗體這幾種導(dǎo)向載體中，二硫鍵抗體、Fab抗體因重鏈和輕鏈之間有二硫鍵

2、相連，穩(wěn)定性較高，但表達(dá)困難或較難獲得較高產(chǎn)量；單鏈抗體有較成熟的原核表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)量較高，但穩(wěn)定性較差。為了解決這一問題，構(gòu)建了抗肝癌單鏈二硫鍵穩(wěn)定抗體(這一新型抗體形式)靶向超抗原SEA(D227A)分子，以提高抗肝癌抗體靶向超抗原SEA(D227A)分子的產(chǎn)量和穩(wěn)定性。單鏈二硫鍵穩(wěn)定抗體(single-chaindisulfide-stabilizedFv，scdsFv)是在單鏈抗體的基礎(chǔ)上，在抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)分

3、別突變出一個半胱氨酸，以完整的一條鏈形式表達(dá)，這樣可在輕、重鏈可變區(qū)之間形成二硫鍵，以達(dá)到提高穩(wěn)定性和產(chǎn)量的目的。 該研究通過連接肽將抗肝癌二硫鍵穩(wěn)定抗體的VH、VL連接起來，構(gòu)建了單鏈二硫鍵穩(wěn)定抗體，這一最具應(yīng)用前景的Fv抗體形式，并將其同超抗原SEA(D227A)融合，構(gòu)建了抗肝癌scdsFv-SEA(D227A)重組表達(dá)質(zhì)粒，以期提高產(chǎn)量和穩(wěn)定性。 ScdsFv-SEA(D227A)重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在

4、大腸桿菌BL21plusS中以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量占菌體蛋白的30％左右。包涵體經(jīng)充分洗滌和變性、復(fù)性后，用QSepharoseHP和Hiprep26/60SephacrylS-200HR進(jìn)行純化，純度達(dá)90％以上，BCA蛋白定量顯示每升誘導(dǎo)菌液的產(chǎn)量高達(dá)60mg，提高了產(chǎn)量。純化蛋白經(jīng)AMS烷化處理并結(jié)合PAGE電泳來檢測二硫鍵形成情況，結(jié)果顯示經(jīng)過變復(fù)性和純化后的重組蛋白形成了二硫鍵。 通過ELISA和MTS分別檢測重組蛋

5、白與肝癌細(xì)胞的結(jié)合活性和細(xì)胞殺傷活性情況，結(jié)果顯示：相比于單鏈抗體靶向超抗原SEA(D227A)分子和二硫鍵抗體靶向超抗原SEA(D227A)分子，單鏈二硫鍵穩(wěn)定抗體靶向超抗原SEA(D227A)分子保持了對肝癌細(xì)胞相同的結(jié)合活性；且其對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性同天然SEA相當(dāng)。 但ELSIA顯示，其穩(wěn)定穩(wěn)定性有了較大提高，重組蛋白能在37℃PBS中9天結(jié)合活性不受影響，而且其還能在5mol/L尿素濃度或56℃水浴中，30min內(nèi)