慢性丙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞干擾素及相關(guān)基因表達(dá)與干擾素療效關(guān)系的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(HepatitisCVires，HCV)感染引起的丙型肝炎仍是嚴(yán)重危害人民健康的重要病毒性疾病。丙型肝炎的主要危害性在于患者易轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?，并可進(jìn)一步發(fā)展為肝癌(HCC)而死亡。目前I型干擾素(下簡(jiǎn)稱(chēng)干擾素)己被臨床廣泛用于慢性丙型肝炎的治療，但尚存在治療效果有限等缺點(diǎn)。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)HCV基因結(jié)構(gòu)、功能、致病性及機(jī)體免疫應(yīng)答等已進(jìn)行了大量研究，但迄今仍不十分清楚HCV與干擾素在機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)如何相互作用以影響機(jī)體對(duì)干擾素的

2、應(yīng)答。本室曾對(duì)丙型肝炎病毒的有關(guān)基因序列進(jìn)行研究，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)相關(guān)氨基酸序列與中國(guó)丙型肝炎病人的干擾素療效有關(guān)。因此，有必要進(jìn)一步探討機(jī)體因素與干擾素療效的相關(guān)性。 HCV感染機(jī)體后可誘生機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素，同時(shí)又可抵抗干擾素的作用。當(dāng)使用外源性干擾素對(duì)病人進(jìn)行治療時(shí)，機(jī)體對(duì)干擾素的應(yīng)答實(shí)際上是病毒，內(nèi)源性干擾素系統(tǒng)與外源性干擾素在體內(nèi)相互作用、平衡的結(jié)果。理論推測(cè)，HCV可能通過(guò)基因復(fù)制和蛋白表達(dá)對(duì)干擾素通路上的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行干

3、預(yù)，使內(nèi)源性干擾素產(chǎn)生不足、信號(hào)通路受阻或干擾素的作用被拮抗，從而導(dǎo)致對(duì)干擾素的治療不敏感；而由于宿主遺傳背景因素差異引起的丙肝病毒感染者體內(nèi)干擾素產(chǎn)生不足、干擾素誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷或干擾素效應(yīng)蛋白表達(dá)水平低下可能是其另一重要原因。 為此，本研究以34例慢性丙型肝炎(chronichepatitisC,CHC)病人為研究對(duì)象，在接受干擾素聯(lián)合利巴韋林治療前、治療1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月和停藥6個(gè)月時(shí)分別收集外周血標(biāo)本

4、，分離血清、血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)后凍存于．80~C一并檢測(cè)。根據(jù)療程結(jié)束時(shí)和停藥6個(gè)月時(shí)血清HCVRNA的檢測(cè)結(jié)果，6例病人對(duì)干擾素非持續(xù)應(yīng)答(包括無(wú)應(yīng)答和復(fù)發(fā)的病人，簡(jiǎn)稱(chēng)NR)，28例病人則對(duì)干擾素持續(xù)應(yīng)答(簡(jiǎn)稱(chēng)SR)。在此基礎(chǔ)上采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-timePCR)方法分別對(duì)不同干擾素療效病人PBMCs中I型干擾素合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗病毒效應(yīng)相關(guān)的基因的表達(dá)水平進(jìn)行研究，并在丙肝病毒亞基因組復(fù)制細(xì)胞系

5、統(tǒng)中驗(yàn)證有關(guān)結(jié)果；同時(shí)用基因芯片檢測(cè)不同干擾素療效病人PBMCs中全基因表達(dá)水平，以搜尋與療效相關(guān)的基因表達(dá)特征(signature)或模式(pattern)。 本研究首先探討I型干擾素及其合成相關(guān)基因的表達(dá)與HCV感染及干擾素療效的關(guān)系。先檢測(cè)了HCV慢性感染情況下PBMCs中IFN-α/β及其合成調(diào)節(jié)因子(IRF．1,IRF-3,IRF-5和IRF-7)的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFN-ot和IFN．B的表達(dá)水平在病人和正常人(do

6、nor)之間沒(méi)有顯著的差異(P值分別為0．927和0．937)，而IRF家族成員的表達(dá)各不相同，其中IRF-3表達(dá)不受慢性感染的影響(P=0．980)，IRF-7表達(dá)在病人與正常人的差異未達(dá)到顯著水平(P=0．071)，但在病人中IRF．1表達(dá)水平明顯增強(qiáng)(P

7、相關(guān)(相關(guān)系數(shù)0．453；P值0．007)；IRF-5表達(dá)與IFN-a和IFN-β的表達(dá)則高度相關(guān)(相關(guān)系數(shù)0．686，0．621；P值<0．00l,0．001)。進(jìn)一步分析I型干擾素及其合成相關(guān)基因的表達(dá)與干擾素療效的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)上述相關(guān)基因在治療前的表達(dá)水平與干擾素療效無(wú)相關(guān)性，不能用于干擾素療效的預(yù)測(cè)。為了確認(rèn)HCV持續(xù)感染對(duì)IRF和I型干擾素的影響，進(jìn)一步在無(wú)HCV復(fù)制的Huh7細(xì)胞和HCV持續(xù)復(fù)制的Replicon細(xì)胞中研究IR

8、F-7和IFN-ct的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NDV攻擊下，Replicon細(xì)胞的IRF-7promoter活性、內(nèi)源性IRF-7和IFN-a表達(dá)水平均較Huh7細(xì)胞低(IRF一7promoter活性上調(diào)倍數(shù)：2．54vs4．20，P<0．001；內(nèi)源性IRF-7mRNA表達(dá)水平：O．137vs1．67l，P

9、被ribavirin和IFN-a降低或基本抑制后，IRF-7promoter活性和內(nèi)源性IRF-7、IFN-a表達(dá)水平均有不同程度的恢復(fù)。上述研究結(jié)果提示，在HCV慢性感染情況下，宿主I型干擾素表達(dá)并無(wú)明顯激活，部分干擾素合成調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平低下，可能為HCV易形成慢性感染的原因之一。此外，I型干擾素及其合成相關(guān)基因在治療前的表達(dá)水平與干擾素療效無(wú)相關(guān)性，不能用于干擾素療效的預(yù)測(cè)。 干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗病毒的效應(yīng)有賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)干擾

10、素信號(hào)通路的效率，為此本研究進(jìn)一步探討了HCV慢性感染對(duì)病人PBMCs中干擾素信號(hào)通路正負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響，并分析正負(fù)調(diào)節(jié)基因的平衡與干擾素療效的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCV慢性感染者與正常人相比，JAK-STAT信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)因子STATl和P48的表達(dá)和負(fù)向調(diào)節(jié)因子SOCSl和SOCS3的表達(dá)均顯著增強(qiáng)(STATl：CHCvsDonors96．5vs69，P=0．039：P48：CSOCSl：CHCvsDonors5．96vs2．1

11、3，P=0．005;SOCS3：CHCvsDonors，78．3vs18．9，P<0．001)；干擾素治療前的SOCSl和SOCS5表達(dá)水平與HCV的復(fù)制水平呈負(fù)相關(guān)(R：．0．427和一0．385；P：0．013和0．027)。鑒于SOCSl和SOCS5主要表達(dá)于Thl細(xì)胞中，以上結(jié)果提示HCV復(fù)制可能會(huì)抑制Thl免疫的形成。進(jìn)一步分析JAK-STAT信號(hào)通路正負(fù)調(diào)節(jié)因子的基因表達(dá)水平與干擾素療效的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)治療前負(fù)調(diào)因子SOCS3

12、的高表達(dá)與干擾素的療效不佳有關(guān)(NRvsSR．203．0vs64．1，P=0．007)，推測(cè)SOCS3的高表達(dá)削弱了細(xì)胞對(duì)外源性干擾素的反應(yīng)能力。鑒于SOCS3主要在Th2細(xì)胞中表達(dá)，非持續(xù)應(yīng)答病人治療前的PBMCs中SOCS3的高水平表達(dá)也提示在Th2類(lèi)免疫狀態(tài)下機(jī)體對(duì)干擾素反應(yīng)低下。利用流式細(xì)胞儀分析應(yīng)答病人在干擾素治療前后PBMCs中γ-干擾素和IL-4分泌細(xì)胞的水平，結(jié)果與SOCS的水平相一致：在干擾素治療過(guò)程中，隨著血清中HC

13、VRNA的下降，SOCSl和SOCS5表達(dá)上調(diào)而SOCS3表達(dá)下調(diào)，Thl和Th2細(xì)胞百分含量也分別呈現(xiàn)增加和減少(Thl：治療前vs治療3個(gè)月，4．28+2．4％vs7．63+3．5％P<0．001；Th2：治療前vs治療3個(gè)月，0．66~0．52％vs0．37+0．53％，P=0．013)，提示其可用于干擾素免疫調(diào)節(jié)效果的監(jiān)測(cè)。進(jìn)一步在體外肝細(xì)胞系中確認(rèn)HCV蛋白表達(dá)和基因復(fù)制對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)SOCSl和SOCS3表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)HCV編

14、碼的Core蛋白可誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞表達(dá)SOCSl和SOCS3,尤其以SOCSl表達(dá)最為顯著，其它HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白則無(wú)此誘導(dǎo)能力。 據(jù)于外源性干擾素治療丙型肝炎的效果主要取決于能否誘導(dǎo)足夠的抗病毒效應(yīng)分子的產(chǎn)生，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了抗病毒效應(yīng)分子MxA，PKR和2’．5’OAS在干擾素治療前及治療過(guò)程中的表達(dá)，并分析其基因表達(dá)與療效的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病人PBMCs中MxA，PKR和2’5’OAS的表達(dá)在干擾素治療前與對(duì)照相比已有明

15、顯增強(qiáng)(MxA：CHCvsDonors141．4vs5．5，P<0．001；PKR：CHCvsDonors75．7vs12．3，P

16、rix公司)的方法檢測(cè)了干擾素持續(xù)應(yīng)答者和非持續(xù)應(yīng)答者的PBMCs在體外用干擾素誘導(dǎo)后的全基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同療效組的基因表達(dá)大部分相似，僅有16個(gè)基因的誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)在不同療效組中有顯著性差異，包括已知的干擾素刺激基因(STATl，GBPl，IFITl，GIP3和IFIT2)，趨化因子基因(CXCLlO和CCL8)，信號(hào)通路相關(guān)蛋白基因(STK3，RASGRP3，RIN2和LEPR)，代謝相關(guān)蛋白基因(APOBEC3A，MANEA和ZC3

17、HAVl)和功能尚不明確的基因(REC8L1和C60ff62)。 綜上所述，本研究的結(jié)果表明，HCV慢性感染對(duì)PBMCs中I型干擾素及其相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。HCV慢性感染情況下，I型干擾素及其合成關(guān)鍵因子的表達(dá)受到抑制，治療前的表達(dá)水平與療效無(wú)關(guān)；干擾素信號(hào)通路的正負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)均被增強(qiáng)，并且負(fù)調(diào)因子SOCS3的表達(dá)水平與療效相關(guān)；抗病毒效應(yīng)分子MxA，PKR和2’．5’OAS的基礎(chǔ)表達(dá)增強(qiáng)，基礎(chǔ)表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)水平均與療效

18、無(wú)關(guān)，同時(shí)基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PBMCs中16個(gè)基因在干擾素誘導(dǎo)下的表達(dá)變化與療效相關(guān)。HCV慢性感染干預(yù)宿主細(xì)胞基因表達(dá)的有關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步利用細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行深入研究；宿主基因表達(dá)與臨床干擾素療效的相關(guān)性研究及其在指導(dǎo)臨床用藥等方面的應(yīng)用，需要在更大的病人樣本中探索和實(shí)踐。本課題的研究結(jié)果一方面能豐富人們對(duì)干擾素誘導(dǎo)抗病毒及HCV拮抗干擾素機(jī)制的認(rèn)識(shí)，另一方面可指導(dǎo)臨床預(yù)測(cè)療效、篩選病人和制定治療方案，最終實(shí)現(xiàn)個(gè)性化的干擾素治療，達(dá)到提高丙