宮內(nèi)生理性低氧微環(huán)境對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎早期腎臟發(fā)育的影響.pdf

1、本文從以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討。
　　第一部分 E13.5大鼠胚胎腎臟體外發(fā)育模型的建立
　　目的:分離E13.5大鼠胚胎后腎(Metanephric kidneys)，采用二維培養(yǎng)法體外培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定，建立大鼠胚胎腎臟體外發(fā)育模型。
　　方法:選取性成熟SD雄性大鼠與雌性大鼠數(shù)只進(jìn)行配種，獲得E13.5天孕鼠。用戊巴比妥麻醉并脫頸處死孕鼠，75％酒精浸泡消毒，在無(wú)菌條件下解剖獲得E13.5胚胎腎臟。培養(yǎng)時(shí)，將胚腎轉(zhuǎn)移至T

2、ranswell filter半透膜上，在6孔板中加入1ml DMEM/F-12培養(yǎng)液（含10％胎牛血清和1％雙抗），于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5％CO2)中連續(xù)培養(yǎng)3-5天。用倒置解剖顯微鏡拍照記錄發(fā)育情況。用免疫熒光染色法對(duì)培養(yǎng)5天的胚腎進(jìn)行標(biāo)志物染色并采用激光共聚焦顯微鏡拍照觀(guān)察。對(duì)培養(yǎng)5天的胚腎進(jìn)行石蠟包埋、切片以及HE染色，觀(guān)察胚腎發(fā)育的結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果:1.E13.5胚腎貼Transwell filter半透膜生長(zhǎng)

3、，組織面積逐漸增大，輸尿管芽分枝逐漸增多，后腎間充質(zhì)逐漸發(fā)生分化;2.免疫熒光染色結(jié)果顯示，胚腎輸尿管芽（E-cadherin標(biāo)記）分枝隨著時(shí)間的增加逐漸增多，培養(yǎng)5天后輸尿管芽成樹(shù)枝狀展開(kāi)，周?chē)植贾谛纬芍械哪I小球（Wt-1標(biāo)記）;3.HE染色顯示培養(yǎng)5d后胚腎中出現(xiàn)大量正在形成的腎小管、腎小球以及集合管樣結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論:體外二維培養(yǎng)法能夠連續(xù)培養(yǎng)E13.5大鼠胚腎至少5天，胚腎具有輸尿管芽分枝和腎小球結(jié)構(gòu)，表明發(fā)育模型基

4、本構(gòu)建成功，滿(mǎn)足體外實(shí)驗(yàn)研究的要求。
　　第二部分 低氧微環(huán)境對(duì)大鼠胚腎體外發(fā)育表型的影響
　　目的:觀(guān)察不同氧分壓低氧微環(huán)境下大鼠胚腎發(fā)育表型的改變。
　　方法:體外分離E13.5大鼠胚胎腎臟，將同一窩胚腎進(jìn)行隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各8-10個(gè)腎臟。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)向培養(yǎng)箱中注入氮?dú)?N2)制造不同氧分壓（1％-5％O2）的低氧條件，模擬發(fā)育時(shí)期宮內(nèi)生理性低氧微環(huán)境，對(duì)照組胚腎則于常規(guī)氧分壓(21％O2)條件下培養(yǎng)。

5、運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)腎臟發(fā)育進(jìn)行染色標(biāo)記（E-cadherin標(biāo)記輸尿管芽，Wt-1標(biāo)記發(fā)育中的腎小球），運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照記錄。統(tǒng)計(jì)并比較兩組胚腎發(fā)育形態(tài)上的差異。
　　結(jié)果:1.極度低氧(1％O2)條件下輸尿管芽分枝和腎小球發(fā)育幾乎停滯，胚腎發(fā)育受到顯著抑制。2.適度低氧（3％O2以及5％O2）條件下體外連續(xù)培養(yǎng)3d，胚腎發(fā)育均受顯著抑制，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組輸尿管芽分枝和發(fā)育中的腎小球數(shù)量較對(duì)照組顯著減少（P＜0.05）

6、。3.適度低氧(5％O2)條件下延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至5d，與對(duì)照組相比輸尿管芽分枝數(shù)和發(fā)育中的腎小球數(shù)目仍顯著減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1％-5％O2低氧環(huán)境能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的大鼠胚腎的發(fā)育，減少輸尿管芽分枝和腎小球形成數(shù)目。
　　第三部分 低氧微環(huán)境影響大鼠胚腎發(fā)育的機(jī)制研究
　　目的:探索低氧微環(huán)境影響體外培養(yǎng)的大鼠胚腎發(fā)育的可能機(jī)制。
　　方法:體外分離E13.5大鼠胚腎，將同一窩胚腎隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和

7、對(duì)照組，每組各8-10個(gè)腎臟。實(shí)驗(yàn)組選取5％O2作為低氧條件模擬宮內(nèi)低氧微環(huán)境，將胚腎置于5％O2低氧環(huán)境培養(yǎng)，對(duì)照組胚腎置于21％O2常氧環(huán)境培養(yǎng)。運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)標(biāo)記胚腎輸尿管芽分枝(anti-E-cadherin)、腎小球(anti-Wt-1)發(fā)育以及后腎間充質(zhì)多能干細(xì)胞(anti-Six2)。運(yùn)用EdU（胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物）摻入法檢測(cè)培養(yǎng)3天后兩組胚腎細(xì)胞增殖情況，運(yùn)用TUNEL（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶）法檢測(cè)培養(yǎng)3天后兩組胚

8、腎細(xì)胞凋亡情況。采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀檢測(cè)相關(guān)基因相對(duì)的表達(dá)RQ值（RQ值=2-△△CT），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所用照片均采用AZ100宏觀(guān)激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝，運(yùn)用美國(guó)NCBI公司Image J軟件進(jìn)行熒光半定量分析，統(tǒng)計(jì)并比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異。
　　結(jié)果:1.與常氧組胚腎相比，低氧組大鼠胚腎細(xì)胞增殖受到顯著抑制，但細(xì)胞凋亡顯著減輕（均P＜0.05）。2.低氧組大鼠胚腎后腎間充質(zhì)多能干細(xì)胞標(biāo)志分子Six2表達(dá)較常氧組顯著增多

9、(P＜0.05)。3.與常氧組相比，低氧組大鼠胚腎基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中代表著后腎間充質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵調(diào)控因子Wnt9b和Wnt4表達(dá)顯著減少，代表足細(xì)胞和腎小管終末細(xì)胞的標(biāo)志分子Nsph2和Aqp1表達(dá)顯著減少（均P＜0.05）;后腎間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行自我更新的關(guān)鍵調(diào)控因子Six2和維持其生存的關(guān)鍵因子Wt-1及Pax2表達(dá)均顯著增多（P＜0.05）。
　　結(jié)論:低氧顯著抑制體外培養(yǎng)條件下大鼠胚腎細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，下調(diào)后