銅綠假單胞菌pvdQ基因?qū)θ杭\(yùn)動(dòng)中抗生素抗性的影響及作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：觀察銅綠假單胞菌pvdQ基因?qū)θ杭\(yùn)動(dòng)（Swarming motility）中抗生素抗性的影響及作用機(jī)制的研究。構(gòu)建銅綠假單胞菌?；妇幋a基因pvdQ基因的高表達(dá)株和突變株，觀察pvdQ基因?qū)θ杭\(yùn)動(dòng)的影響及在群集運(yùn)動(dòng)條件下對(duì)抗生素抗性的改變及其作用的機(jī)制。
　　 方法：利用電穿孔的方法構(gòu)建pvdQ基因的空質(zhì)粒株、高表達(dá)株和突變株，并用熒光定量PCR比較上述三種菌株在銅綠假單胞菌PAO1 野生株中的表達(dá)。將PAO1 野生株

2、、pvdQ基因的空質(zhì)粒株、高表達(dá)株和突變株分別置于群集運(yùn)動(dòng)瓊脂培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，觀察比較群集運(yùn)動(dòng)直徑的大小。用E 試驗(yàn)法測(cè)PAO1 野生株和pvdQ基因的高表達(dá)株的MIC 值。根據(jù)MIC 值將PAO1 野生株和pvdQ基因的高表達(dá)株置于含有不同濃度抗生素的培養(yǎng)皿中過(guò)夜培養(yǎng)，比較兩者群集運(yùn)動(dòng)直徑的大小。將PAO1 野生株和高表達(dá)株在電鏡下觀察群集運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的形態(tài)。采用結(jié)晶紫染色法，觀察比較PAO1 野生株和pvdQ基因的高表達(dá)株培養(yǎng)24h，

3、24h和72h的生物膜的生長(zhǎng)情況。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察PAO1 野生株和pvdQ基因的高表達(dá)株生長(zhǎng)24h，24h和72h 時(shí)生物膜的厚度。用熒光染料NPN在熒光分光光度計(jì)中比較PAO1 野生株和pvdQ 高表達(dá)株對(duì)膜通透性的改變。采用熒光定量PCR法比較PAO1和pvdQ 高表達(dá)株多重耐藥外排泵MexAB-OprM的oprM基因和MexGHI-opmD的mexI基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：熒光定量PCR結(jié)果顯示，成功構(gòu)建p

4、vdQ基因空質(zhì)粒株、高表達(dá)株和突變株。比較四株菌的群集運(yùn)動(dòng)直徑變化：空質(zhì)粒株與PAO1 野生株相比較，直徑無(wú)顯著變化；突變株與PAO1 野生株相比較，直徑減小；高表達(dá)株與PAO1野生株相比較，直徑增大。E 試驗(yàn)結(jié)果顯示銅綠假單胞菌對(duì)上述5中抗生素均敏感，而PAO1 野生株和pvdQ 高表達(dá)株之間差異不明顯。比較PAO1 野生株和pvdQ高表達(dá)株兩株菌在含有不同濃度抗生素的培養(yǎng)皿中群集運(yùn)動(dòng)直徑大?。嚎股貪舛瘸杀对黾?，但群集運(yùn)動(dòng)直徑不是成

5、倍下降而是成不規(guī)則增加，說(shuō)明PAO1 野生株和高表達(dá)株均能提高抗生素抗性；PAO1在頭孢他啶濃度>8μg/ml，環(huán)丙沙星濃度>0.4μg/ml，美羅培南濃度>4μg/ml，多粘菌素B 濃度>16μg/ml，慶大霉素>8μg/ml 時(shí)群集運(yùn)動(dòng)被抑制；而pvdQ 高表達(dá)株是在頭孢他啶濃度>32μg/ml，環(huán)丙沙星濃度>1.6μg/ml，美羅培南濃度>16μg/ml，多粘菌素B 濃度>64μg/ml，慶大霉素濃度>64μg/ml 時(shí)群集運(yùn)動(dòng)被

6、抑制。因此，pvdQ 高表達(dá)株與PAO1 野生株相比抗性提高了2-8倍。電鏡觀察結(jié)果：pvdQ高表達(dá)株分化的群集細(xì)胞與PAO1 野生株相比較細(xì)胞變長(zhǎng)，核質(zhì)增多。結(jié)晶紫染色的結(jié)果顯示：培養(yǎng)24h PAO1 野生株、高表達(dá)株和突變株形成的生物膜厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，培養(yǎng)48h和72h 時(shí)與PAO1 野生株相比高表達(dá)株生物膜明顯變薄，PAO1 野生株與突變株相比較突變株生物膜明顯增厚。
　　 用激光共聚焦顯微鏡觀察PAO1 野生株和p

7、vdQ 高表達(dá)株在培養(yǎng)12h，24h和72h 時(shí)生物膜的厚度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：72hpvdQ 高表達(dá)株較PAO1 野生株生物膜明顯變薄。將pvdQ基因與外膜通透性、多重耐藥外排泵基因做了相關(guān)性的研究，研究結(jié)果顯示：pvdQ高表達(dá)株與PAO1 野生株相比較，pvdQ 高表達(dá)株能夠明顯降低外膜通透性。對(duì)多重耐藥外排泵基因表達(dá)的結(jié)果顯示：oprM基因和mexI基因在群集細(xì)胞中，PAO1 野生株和pvdQ 高表達(dá)株的表達(dá)明顯高于浮游細(xì)菌細(xì)胞，但群集細(xì)

8、胞之間的比較PAO1 野生株和pvdQ 高表達(dá)株的oprM基因和mexI基因表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論：pvdQ 高表達(dá)株促進(jìn)群集運(yùn)動(dòng)直徑，突變株則抑制群集運(yùn)動(dòng)直徑，說(shuō)明pvdQ基因可能參與調(diào)控銅綠假單胞菌PAO1 野生株的群集運(yùn)動(dòng)。在群集運(yùn)動(dòng)條件下銅綠假單胞菌pvdQ 高表達(dá)株與PAO1 野生株相比較能夠?qū)㈩^孢他啶、環(huán)丙沙星、美羅培南、多粘菌素B和慶大霉素的抗性提高2-8倍，細(xì)菌群集運(yùn)動(dòng)被抑制的抗生素濃度均顯著性的高于MIC