microRNA-429在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)及其與P53表達(dá)的關(guān)系.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜癌(endometrialcarcinoma，EC)是原發(fā)于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，為婦科三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20％-30％。近年來(lái)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率不斷上升，且有年輕化趨勢(shì)。盡管多年來(lái)對(duì)子宮內(nèi)膜癌開展了大量的研究，目前對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的確切病因仍不太清楚。因此，探索子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制，攻克這一疾病是目前亟待解決的問(wèn)題。microCRNA(簡(jiǎn)寫為miRNA，miR)是一類由大約19—25個(gè)核苷酸組成

2、的非編碼小分子RNA，能夠通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式，與特異的靶mRNA的3'UTR或編碼區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而抑制靶mRNA的翻譯或直接降解mRNA，最終抑制基因的表達(dá)。早在1993年，Lee等在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA——lin-4，2000年又發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)miRNA——let-7，從此掀起了miRNA研究的熱潮。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化、增殖、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。不同的miRNA對(duì)細(xì)胞

3、生長(zhǎng)具有不同的調(diào)控作用，相同的miRNA對(duì)不同細(xì)胞株的調(diào)控作用亦不同。而且miRNA可調(diào)節(jié)眾多癌基因和抑癌基因，在腫瘤中miRNA表達(dá)異常上調(diào)或下調(diào)。近來(lái)，作為眾多miRNA基因組中一員的miR-200家族，在腫瘤學(xué)上的作用越來(lái)越受到重視。miR-200家族主要包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429五個(gè)成員。根據(jù)編碼miRNA-200家族的基因定位可分為:miR-200a/miR-200

4、b/miR-429和miR-200c/miR-141兩組，在人類，miR-200a/miR-200b/miR-429編碼基因位于1號(hào)染色體p36.33，而miR-200c/miR-141編碼基因位于12號(hào)染色體p13.31。在研究miRNA的過(guò)程中，Wu等利用基因芯片檢測(cè)10組子宮內(nèi)膜組織，與對(duì)照組相比子宮內(nèi)膜癌組織中17個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，6個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)，其中miR-429表達(dá)上調(diào)。梁靜等利用基因芯片研究子宮內(nèi)膜樣腺癌組

5、織中miRNA差異表達(dá)譜時(shí)，也發(fā)現(xiàn)miR-429的表達(dá)明顯上調(diào)。最近國(guó)外也有人檢測(cè)到miR-200家族在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，且在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中應(yīng)用anti-miR-200家族后發(fā)現(xiàn)anti-miR-429能顯著抑制Ishikawa細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究還發(fā)現(xiàn)miRNA與P53關(guān)系密切，與P53在多種腫瘤的發(fā)生過(guò)程中形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。P53是目前腫瘤界研究最多最深入的抑癌基因之一，定位于17號(hào)染色體短臂17p13.1，該基因具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄

6、、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡的作用，而它的突變和缺失是導(dǎo)致許多腫瘤發(fā)生的原因。研究表明P53與子宮內(nèi)膜癌的臨床分級(jí)、病理分型、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且有文獻(xiàn)報(bào)道P53與術(shù)后血清CA125的水平相一致，兩者結(jié)合可以作為判斷預(yù)后、指導(dǎo)臨床治療的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-429的反義寡核苷酸(AS-miR-429)抑制miRNA-429的表達(dá)，觀察miRNA-429被抑制后子宮內(nèi)膜癌Is

7、hikawa細(xì)胞的增殖與凋亡情況，并研究子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中miRNA-429與P53之間是否存在表達(dá)作用關(guān)系，探討miRNA-429在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，從而為子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷及治療提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:1.用含10％FBS胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞。2.待細(xì)胞90％融合時(shí)轉(zhuǎn)染，將實(shí)驗(yàn)分四組:空白對(duì)照組（即不轉(zhuǎn)染組）、陰性對(duì)照組

8、（即轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列miR-429抑制劑組）、實(shí)驗(yàn)組（即轉(zhuǎn)染特異性miR-429抑制劑組）、轉(zhuǎn)染試劑組（即只加入轉(zhuǎn)染試劑組）。3.用CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖活性變化。4.用Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡情況。5.用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)miR-429和P53的相對(duì)表達(dá)量。6.用Westernblot檢測(cè)P53的蛋白表達(dá)。7.采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:相比空白

9、對(duì)照組和轉(zhuǎn)染試劑組，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)都受到明顯抑制（陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖活性低于實(shí)驗(yàn)組）;實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡明顯增多，凋亡率為（28.45±2.62）高于空白對(duì)照組（3.34±1.02）和轉(zhuǎn)染試劑組（4.19±1.13），但低于陰性對(duì)照組（41.23±3.62），與各組間比較均有顯著性差異(P＜0.05)。實(shí)時(shí)定量檢測(cè)結(jié)果顯示在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中有miR-429的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組中miR-429的表達(dá)量明顯

10、低于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染試劑組，相應(yīng)兩組中P53mRNA的表達(dá)量也有所下降;Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組P53蛋白的表達(dá)有所上調(diào)，但與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染試劑組相比差異不顯著(P＞0.05)，而陰性對(duì)照組P53蛋白的表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論:在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中有miR-429的表達(dá)，在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中加入AS-miRNA-429雖然可以抑制P53mRNA的表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但不具