糖尿病足部非缺血性皮膚潰瘍與巨噬細(xì)胞功能障礙關(guān)系的研究.pdf

1、[背景]： 糖尿病足部潰瘍是臨床上常見的糖尿病慢性并發(fā)癥，常導(dǎo)致創(chuàng)面難愈合，是導(dǎo)致截肢的主要原因之一，不僅給患者造成巨大的精神壓力，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，同時(shí)還造成沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病患者足部潰瘍的發(fā)病率為4％-10％。隨著糖尿病發(fā)病率的迅速上升，這一并發(fā)癥將呈明顯增多的趨勢(shì)。深入研究糖尿病足部潰瘍創(chuàng)面難愈合的機(jī)制，尋找新的預(yù)防和治療方法是當(dāng)今的一項(xiàng)重要課題。 皮膚的創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜卻有序的生物過程，在每個(gè)時(shí)

2、期都有許多組織、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子等參與，涉及一系列的生物學(xué)過程，如：出血、血管反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、肉芽組織形成、再上皮化及修復(fù)后的重塑等。巨噬細(xì)胞是創(chuàng)面修復(fù)的重要參與者。巨噬細(xì)胞不但具有吞噬和清除異物、壞死組織的功能，而且能分泌多種細(xì)胞因子參與修復(fù)。Shirafuji等發(fā)現(xiàn)：巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)受阻是手術(shù)后病人傷口愈合延遲的一個(gè)重要原因。當(dāng)巨噬細(xì)胞分泌功能障礙可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)不足，從而影響創(chuàng)面修復(fù)的進(jìn)程。研究顯示：皮膚組織中，巨噬細(xì)胞是分泌血管

3、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGFC)的主要細(xì)胞之一。在糖尿病期間，局部的高糖環(huán)境可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的功能損傷。當(dāng)巨噬細(xì)胞不能活化或者數(shù)量減少時(shí)，局部組織中VEGFC減少，可能影響到創(chuàng)面炎癥期和修復(fù)期的淋巴管的形成。 淋巴管形成的激活受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，涉及一系列的連續(xù)而有序的步驟，這些步驟和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、出芽生成不同，淋巴管內(nèi)皮是以單個(gè)細(xì)胞移行，然后連接成管型結(jié)構(gòu)的。淋巴管內(nèi)皮的增殖受多種因子和因素的調(diào)節(jié)，主要分為正向調(diào)節(jié)因素和負(fù)向

4、調(diào)節(jié)因素。正向調(diào)節(jié)因素主要有：VEGF家族、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)家族和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。腫瘤壞死因子α(TNF-α)為負(fù)向調(diào)節(jié)因素。 VEGF是一種肝素結(jié)合型糖蛋白，是一種特異性的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子。VEGFC是VEGF家族的重要成員，可以通過和血管內(nèi)皮上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)以及淋巴管內(nèi)皮上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(VEGFR3)結(jié)合，引起血管和淋巴管的增殖。VEGFC和VEGFR3

5、的結(jié)合能力遠(yuǎn)高于VEGFC和VEGFR2的結(jié)合能力，所以VEGFC對(duì)淋巴管的影響比對(duì)血管的影響可能更為重要。VEGFC與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體VEGFR3結(jié)合，激發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和管腔形成等淋巴管新生過程，發(fā)揮其促淋巴管生成的作用。 有研究發(fā)現(xiàn)皮膚淋巴管在創(chuàng)面炎癥反應(yīng)階段可以向反應(yīng)區(qū)域運(yùn)輸樹突狀細(xì)胞等，說明皮膚淋巴管除了局部引流、清除反應(yīng)產(chǎn)物等作用外，還是炎癥反應(yīng)的參與者。也有研究顯示：在糖尿病db/db小鼠皮膚潰瘍組織

6、中，分泌VEGFC的巨噬細(xì)胞數(shù)量和活力明顯降低，并由此導(dǎo)致淋巴管的形成減少，最終引起糖尿病小鼠潰瘍難愈合。研究者使用白細(xì)胞介素1β(IL-1β)處理小鼠骨髓的巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞的分泌活性明顯得到恢復(fù)，使用這種恢復(fù)功能的巨噬細(xì)胞處理db/db小鼠創(chuàng)面，可以見到創(chuàng)面愈合速度明顯加快，通過激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)出淋巴管的形成增加。由此推斷：在糖尿病發(fā)病過程中，皮膚組織中的巨噬細(xì)胞數(shù)量和功能降低，導(dǎo)致局部的VEGFC生成減少，不能形成足夠的淋巴

7、管，從而導(dǎo)致了創(chuàng)面炎癥反應(yīng)不足和愈合延遲。 臨床上我們發(fā)現(xiàn)有的患者創(chuàng)面血液供應(yīng)充分，檢測(cè)踝臂指數(shù)(ABI)>0.7，未見明顯的感染，創(chuàng)面愈合依然非常緩慢。是否由于糖尿病患者皮膚組織中的巨噬細(xì)胞功能降低，導(dǎo)致局部的VEGFC生成減少，不能形成足夠的淋巴管，從而導(dǎo)致了創(chuàng)面炎癥反應(yīng)不足和愈合延遲?高血糖和/或糖基化終末產(chǎn)物(AGE)是否可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞分泌VEGFC的功能降低，是否可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬功能降低，從而導(dǎo)致創(chuàng)面炎癥反應(yīng)不足

8、和愈合延遲? 基于已有的研究結(jié)果及對(duì)上述問題的思考，我們選取糖尿病足部非缺血性潰瘍皮膚、非糖尿病足部潰瘍皮膚、正常皮膚組織為研究對(duì)象，應(yīng)用RT-PCR和免疫組化的方法，檢測(cè)三組皮膚組織VEGFCmRNA和蛋白的表達(dá)水平，從分子生物學(xué)技術(shù)水平探討VEGFC在糖尿病足部非缺血性潰瘍難愈合的作用機(jī)制。并研究U937細(xì)胞經(jīng)不同濃度的葡萄糖、AGE及葡萄糖和AGE聯(lián)合刺激培養(yǎng)不同時(shí)間后，U937細(xì)胞VEGFC基礎(chǔ)分泌量和吞噬能力的改變，為

9、進(jìn)一步預(yù)防和治療糖尿病足部非缺血性潰瘍提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究分為以下兩部分進(jìn)行： 第一部分：VEGFC在糖尿病足部非缺血性潰瘍皮膚組織中表達(dá)的研究 [目的]： 觀察VEGFC在糖尿病足部非缺血性潰瘍皮膚組織中的表達(dá)并與正常皮膚組織和非糖尿病足部潰瘍皮膚進(jìn)行比較，探討VEGFC在糖尿病足部非缺血性潰瘍難愈合的作用機(jī)制。 [方法]： 1.以糖尿病足部非缺血性潰瘍皮膚組織(DF組)為研究對(duì)象，

10、非糖尿病足部潰瘍皮肽組織(NDF組)和正常皮膚組織(NC組)為對(duì)照。 2.記錄提供標(biāo)本的患者的年齡、糖尿病史和潰瘍形成時(shí)間。 3.RT-PCR法檢測(cè)三組皮膚VEGFCmRNA的表達(dá)。 4.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)三組皮膚VEGFC蛋白的定位和表達(dá)。 5.使用SPSS13.0軟件處理所有數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，三組之間數(shù)據(jù)采用one-wayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)分析，方差不齊的采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析或者采用非參數(shù)檢驗(yàn)；設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 [結(jié)果]： 1.三組平均年齡比較無顯著性差異(P>0.05)，DF組與NDF組的潰瘍形成時(shí)間比較無顯著性差異(P>0.05)。 2.與NC組比較，DF組VEGFCmRNA表達(dá)顯著減少(P<0.001)，NDF組VEGFCmRNA表達(dá)顯著增加(P<0.001)。 3.與NC組比較，DF組VEGFC蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.

12、001)，NDF組VEGFC蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.001)。 [結(jié)論]： 糖尿病足部非缺血性潰瘍皮膚組織VEGFCmRNA和蛋白表達(dá)減少，可能是導(dǎo)致局部皮膚中的淋巴管形成障礙，從而引起糖尿病足部非缺血性潰瘍炎癥反應(yīng)不足、創(chuàng)面修復(fù)受損的原因之一。 第二部分：高糖或/和AGE對(duì)U937細(xì)胞功能影響的研究 [目的]： 觀察U937細(xì)胞經(jīng)葡萄糖或/和AGE刺激后，VEGFC的基礎(chǔ)分泌量和吞噬功能，與正

13、常細(xì)胞進(jìn)行比較，探討葡萄糖或/和AGE對(duì)U937細(xì)胞分泌VEGFC的功能和吞噬功能的影響。 [方法]： 1.以U937細(xì)胞為研究對(duì)象，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：葡萄糖的最佳刺激濃度為15mM，AGE濃度的最佳刺激濃度為25μg/ml，最佳刺激時(shí)間均為24h，將實(shí)驗(yàn)分為以下四組：15mM葡萄糖組(GLU組)、25μg/mlAGE組(AGE組)、聯(lián)合培養(yǎng)組(CC組)、正常對(duì)照組(NC組)。 2.臺(tái)盼蘭染色試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞活力。

14、 3.RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞VEGFCmRNA的表達(dá)。 4.免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)各組細(xì)胞VEGFC蛋白的表達(dá)。 5.墨汁吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞吞噬能力。 6.使用SPSS13.0軟件處理所有數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組之間數(shù)據(jù)采用one-wayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差不齊的采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析或者采用非參數(shù)檢驗(yàn)；設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)±=0.05。

15、 [結(jié)果]： 1.臺(tái)盼蘭染色試驗(yàn)結(jié)果顯示各組細(xì)胞活力比較，無顯著性差異(P>0.05)。 2.RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示NC組細(xì)胞VEGFCmRNA表達(dá)最高，AGE組VEGFCmRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05)，GLU組、CC組VEGFCmRNA表達(dá)顯著減少(P<0.001)。CC組和GLU組比較，VEGFCmRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05)，CC組和AGE組比較，VEGFCmRNA表達(dá)顯著減少(P<0.001)。

16、 3.免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)結(jié)果顯示NC組細(xì)胞VEGFC蛋白表達(dá)最高，GLU組、AGE組和CC組VEGFC蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.001)，CC組和GLU組、AGE組比較，VEGFC蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.001)。 4.墨汁吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NC組細(xì)胞吞噬能力最高，AGE組吞噬能力顯著降低(P<0.05)，GLU組吞噬能力顯著降低(P<0.01)，CC組吞噬能力顯著降低(P<0.001)。CC組和GLU組比較，吞噬能

17、力顯著降低(P<0.05)，CC組和AGE組比較，吞噬能力顯著降低(P<0.01)。 [結(jié)論]： 1.高糖、AGE刺激及葡萄糖和AGE聯(lián)合刺激可使U937細(xì)胞VEGFCmRNA和蛋白表達(dá)減少。高糖和AGE刺激可能是糖尿病患者皮膚組織中VEGFC表達(dá)減少的重要原因之一。 2.高糖、AGE刺激及葡萄糖和AGE聯(lián)合刺激可使U937細(xì)胞吞噬能力下降。高糖和AGE刺激可能是導(dǎo)致糖尿病足部炎癥反應(yīng)不足，從而引起糖尿病足部非缺