MicroRNA在心臟重塑、逆重塑過程中的變化及可能作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景： 在現(xiàn)代工業(yè)社會中，心功能不全、心衰已經(jīng)成為病人住院和死亡的主要因素，其臨床表現(xiàn)主要為心臟的擴(kuò)大和重塑。心肌梗死，高血壓，主動(dòng)脈狹窄，瓣膜病變等心臟疾病都會造成血液動(dòng)力學(xué)及神經(jīng)內(nèi)分泌的變化，而這些變化往往會引起心肌細(xì)胞內(nèi)分子通路或轉(zhuǎn)移通路的病理性變化，在壓力負(fù)荷的作用下心臟往往表現(xiàn)為肥大，心肌重塑等改變。而當(dāng)今左心輔助已經(jīng)被用來作為心功能不全病人心臟移植前的過渡治療，起一定的橋梁作用，或作為改善心肌功能儲備，來改善心衰

2、患者愈后的有力手段。并且在EmmaJ等人的一些試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對于一些非心梗病人，左心輔助結(jié)合藥物治療能顯著改善患者愈后，在輔助一段時(shí)間后，撤離左心輔助，這些病人的心功能較前有明顯改善，生活能力有顯著好轉(zhuǎn)。左心輔助已成為心功能不全的有效治療手段，其對于心肌的重塑，心肌微結(jié)構(gòu)的恢復(fù)及相關(guān)基因和蛋白成分的逆轉(zhuǎn)均有作用。 MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約21-23個(gè)堿基，它能通過對mRNA的表達(dá)進(jìn)行抑制從而對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控

3、，在腫瘤，病毒，細(xì)胞增殖，凋亡等各個(gè)方面起作用?，F(xiàn)在大量的研究表明，miRNA與心臟疾病有著密切的相關(guān)性，2005年DRZhao首先發(fā)現(xiàn)miRNA-1-2被特定性在心臟中存在并通過Hand2通道起作用，圍繞miRNA的心臟作用的研究由此展開。迄今為止已發(fā)現(xiàn)miRNA在心肌肥大，心肌梗死后心律失常中起作用，并參與心肌的凋亡，其中miR-1，195，212，208，133等已經(jīng)被證實(shí)通過不同的分子通路在上述的各個(gè)方面起作用。但關(guān)于miRNA

4、和心肌逆重塑相關(guān)性方面的相關(guān)研究未見報(bào)道，通過我們的研究我們希望找到其中的相關(guān)性。大鼠異位心臟移植現(xiàn)在作為研究左心卸負(fù)荷對于正常心臟，肥大及心衰心臟的造成的基因或分子生物學(xué)改變的一個(gè)廣泛運(yùn)用的工具。本研究將試圖通過同源腹腔異位移植肥大心臟來創(chuàng)建大白鼠心衰后機(jī)械減負(fù)模型來模擬臨床使用LVAD患者，尋找miRNA和心肌重塑之間的相關(guān)性，為探討LVAD患者臨床康復(fù)的機(jī)制打下基礎(chǔ)，為探討人類心衰后使用左心輔助裝置的恢復(fù)機(jī)制提供新的方法。

5、 方法： 健康的近交系Lewis雄性大鼠體重180～200g，采用分組研究的方法，分為實(shí)驗(yàn)對照組，心肌肥厚組，心肌肥厚卸負(fù)荷組3組。通過腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制造心肌肥厚模型，術(shù)后6周經(jīng)超聲心動(dòng)圖篩選，以經(jīng)超聲心動(dòng)圖篩選的肥厚模型作為供體，與同窩的大鼠行腹部異位心臟移植術(shù)。肥厚移植組，術(shù)后2周行心超檢測，觀察期滿后處死動(dòng)物取出心臟，取其左室游離壁，稱重并行常規(guī)病理(石蠟切片及HE染色和天狼星紅染色)觀測心肌細(xì)胞及蛋白、膠原變化。取各組部

6、分左室游離壁心肌組織TRlzol法提取RNA，用miRNeasy提取miRNA，測其濃度，行miRNA基因芯片檢測，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，觀察3組miRNA變化。取各組組間相差大于2倍的基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行篩選，并查找在各組中均有變化，而且變化倍數(shù)大于2倍的miRNA行實(shí)時(shí)定量qRT-PCR檢測，以U6為內(nèi)參，染料法驗(yàn)證各組之間目的miRNA的變化。 結(jié)果： 1、復(fù)制腹主動(dòng)脈縮窄模型35例，6周后符合心肌肥厚模型的有25例，成功率為7

7、1％。復(fù)制肥厚移植模型15例，成功9例，成功率60％。 2、經(jīng)心肌肥厚模型后的心臟重量較假手術(shù)組有明顯增加，心臟重量比大鼠整體重量比也有明顯增加，心肌肥厚經(jīng)卸負(fù)荷后大鼠心臟重量及心臟與整體重量比較術(shù)前有明顯減少。 3、心臟超聲檢查結(jié)果顯示：心肌肥大模型組相對對照組心臟的左室舒張末期左室前壁厚度(LVAWd)；左室舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)均有明顯增加(p＜0.05)；而相對與心肌肥大模型組，肥大后卸負(fù)荷組的左室舒

8、張末期左室前壁厚度(LVAWd)；左室舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)有明顯下降(p＜0.05)：各組左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)比較均無明顯差別。 4、HE染色可見心肌肥大模型組心肌橫截面積(CSA)較對照組增加了135％，而肥大后卸負(fù)荷組的心肌橫截面積(CSA)較心肌肥大組下降了54％。 5、心肌膠原經(jīng)天狼星紅染色檢測其變化，膠原呈紅色，細(xì)胞核呈綠色，其它成分呈黃色，在心肌肥大組，心肌肥大卸負(fù)荷組中膠原表達(dá)較對

9、照組均有明顯增加。 6、將3組心肌游離壁心肌組織提取miRNA行miRNA基因芯片技術(shù)檢測各組間miRNA的改變，及相差倍數(shù)。發(fā)現(xiàn)各組中有293個(gè)miRNA發(fā)生了改變，其中有40個(gè)miRNA發(fā)生2倍以上改變。其中相差大于2倍的在心肌肥大模型組相對于對照組其中有1個(gè)miRNA升高，有8個(gè)miRNA下降；而肥大后卸負(fù)荷組相對于肥大組中有28個(gè)miRNA升高，而有10個(gè)miRNA下降。 7、我們將各組中有連續(xù)相關(guān)性變化的miR

10、NA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量qRT-PCR檢測，共對6個(gè)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4組發(fā)生了顯著性變化。各組間ΔΔCT差大于2倍。 結(jié)論： 大鼠心肌肥厚及肥厚卸負(fù)荷模型能較好的模擬左心輔助卸負(fù)荷過程。在肥厚過程中，心肌組織及細(xì)胞均出現(xiàn)了正向改變，而經(jīng)卸負(fù)荷后部分逆轉(zhuǎn)，但膠原組織逆轉(zhuǎn)不良。較多miRNA在肥厚及卸負(fù)荷過程中發(fā)生了改變，經(jīng)過對部分改變較顯著的miRNA作用靶點(diǎn)的查找發(fā)現(xiàn)，miR-23a、26a、29a、212等可能通