黑色素瘤相關(guān)抗原Restin和轉(zhuǎn)錄因子ATF3相互作用效應(yīng)的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、Restin是1999年本校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室在研究全反式維甲酸誘導(dǎo)細胞分化時克隆得到的一個未知功能的人類新基因,2001年,Chomez等通過同源序列篩選Genebank數(shù)據(jù)庫,也發(fā)現(xiàn)了該基因,并命名為MAGE-H1,該基因主要表達于終末分化細胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染該基因的細胞出現(xiàn)G1期阻滯,抑制細胞的增殖,提示Restin與細胞周期的調(diào)控有關(guān)。但有關(guān)該基因的具體生物學(xué)功能研究還未見報道。 實驗前期研究利用細胞雙雜交技術(shù),對Re

2、stin在細胞周期中可能的作用的轉(zhuǎn)錄因子(ATF3、ATF4、E2F6、C-JUN、C-FOS、p53)進行了雙雜交篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATF3與Restin表現(xiàn)出很強的相互作用。為了進一步驗證ATF3與Restin的相互作用,對ATF3進行截短并構(gòu)建了一系列ATF3的截短片段的雙雜交質(zhì)粒,再次運用細胞雙雜交進行相互作用的探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Restin與ATF3的確存在相互作用,并作用于ATF3的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ATF3bindingdomai

3、n,ATF3/BD),不完整的ATF3/BD降低了Restin與ATF3相互作用能力,進一步證實了Restin與ATF3相互作用。 激活轉(zhuǎn)錄因子—3(ActivatingTranscriptionFactor3,ATF3)是一種具有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basicleucinezipper,bZIP)的cAMP應(yīng)答元件結(jié)合的蛋白質(zhì)(cAMP-responsiveelementbindingprotein,CREB)家族中的轉(zhuǎn)錄因子

4、,具有廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。ATF3通過和具有特異性結(jié)合位點ATF/CRE(TGACGTCA)或者AP-1的因子結(jié)合而發(fā)揮其功能。ATF3是細胞應(yīng)激反應(yīng)中最早表達的轉(zhuǎn)錄因子之一,ATF3在正常的條件下以及靜息狀態(tài)表達很低,但是多種細胞外刺激信號可以誘導(dǎo)其表達,細胞的mRNA水平在暴露于壓力信號時會增高很多。目前發(fā)現(xiàn)在動物模型,ATF3表達增高見于心肌缺血及缺血-再灌注損傷、肝臟缺血及酒精或四氯化碳等化學(xué)藥物中毒、癲癇發(fā)作、腎臟的缺血-再灌

5、注損傷、皮膚外傷及外周神經(jīng)離斷;在培養(yǎng)的細胞ATF3可以被大量的信號誘導(dǎo),包括:細胞因子、具有遺傳毒性的因素如紫外線及電離輻射、已知的能引起細胞死亡或激活JNK/SAPK途徑的因子如茴香毒素(抗滴蟲藥)和阿霉素等。近來又有很多研究發(fā)現(xiàn)了更多新的可以誘導(dǎo)ATF3表達的壓力性因素。盡管這些證據(jù)無疑可以證明ATF3是一個壓力誘導(dǎo)基因,但是關(guān)于對ATF3的調(diào)控及其生理功能目前研究甚少。 ATF3作為組織或細胞生理壓力性誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)中最早

6、表達的轉(zhuǎn)錄因子之一,一方面,ATF3可以誘導(dǎo)細胞從靜止期進入細胞周期;另一方面它又可阻止毒性物質(zhì)誘導(dǎo)的細胞凋亡。激活的ATF3可以通過JNK/SAPK信號傳遞途徑抑制細胞內(nèi)部分基因的轉(zhuǎn)錄和細胞的增殖。因此我們推測Restin對細胞增殖的調(diào)控作用可能與對ATF3活性的調(diào)控有關(guān)。 為了證實這一想法,進一步研究Restin和ATF3相互作用的效應(yīng),我們必須建立一個可以進行活體檢測ATF3轉(zhuǎn)錄活性的報告系統(tǒng),當(dāng)然要求這個報告系統(tǒng)可以在細

7、胞內(nèi)有效地檢測ATF3的活性。為了構(gòu)建這個報告系統(tǒng),利用了Promega公司的載體質(zhì)粒pG5luc,它帶有螢火蟲熒光素酶基因,在其上游依次為腺病毒啟動子,5個GAL-4結(jié)合位點,通過酶切連接用ATF3的特異性結(jié)合位點ATF/CRE序列完全取代GAL4結(jié)合位點,構(gòu)建完成ATF3報告質(zhì)粒pATF/CRE-luc。實驗結(jié)果表明在Hela和NIH3T3細胞內(nèi),熒光素酶的表達量在共轉(zhuǎn)染ATF3和ATF/CRE實驗組較之單獨轉(zhuǎn)染ATF/CRE組要高

8、得多,且螢火蟲熒光素酶的表達量和轉(zhuǎn)染的ATF3劑量呈正相關(guān),這說明我們成功構(gòu)建了在細胞內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄活性的ATF3活性報告系統(tǒng)。實驗結(jié)果也表明在Hela和NIH3T3細胞內(nèi)ATF3的基礎(chǔ)活性很低,能夠更準確地反應(yīng)各種刺激因素對其的調(diào)控影響。無疑,這個報告系統(tǒng)有助于我們進一步研究Restin和ATF3的相互作用,當(dāng)然也可以為我們進一步研究在不同細胞和不同壓力狀態(tài)下ATF3的表達調(diào)控提供一個有力的工具。 利用構(gòu)建的ATF3的報告系統(tǒng)pA

9、TF/CRE-luc,對Restin與ATF3相互作用效應(yīng)進行了一系列的分析。為檢測Restin對ATF3轉(zhuǎn)錄激活的影響,我們將ATF3和Restin基因的表達質(zhì)粒pACT/ATF3和pACT/Restin及報告基因pATF/CRE-luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞,結(jié)果顯示:在表達ATF3的情況下,共轉(zhuǎn)染Restin可以增強ATF3的轉(zhuǎn)錄激活,將ATF3-BD和Restin的表達質(zhì)粒及報告基因pATF/CRE-luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染NIH3

10、T3細胞,結(jié)果顯示ATF3-BD可以部分阻抑Restin與ATF3相互作用效應(yīng),進一步證實了Restin對報告系統(tǒng)熒光素酶表達的增強效應(yīng)是通過Restin與ATF3的相互作用實現(xiàn)的。在Hela和A549細胞重復(fù)上述實驗得到一致的結(jié)果。 為了進一步證實在細胞中Restin和ATF3相互作用的效應(yīng),對ATF3調(diào)控的下游靶基因CyclinD1的表達進行了觀察。CyclinD1具有延遲早期表達的動力學(xué)特性,在G1時相的中晚期達到峰值,C

11、yclinD1的這種表達特性符合作為ATF3目的基因的條件;更重要的是,CyclinD1的啟動子區(qū)包含ATF3的兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,在2953位點的一個AP-1(TGAGTCAG)序列及254位點的一個ATF/CRE(TAACGTCA)序列;最后CyclinD1的啟動子已經(jīng)被證實與bZIP家族的轉(zhuǎn)錄因子激活,包括c-Jun,c-Fos,F(xiàn)osB和ATF2。并且,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ATF3在肝細胞的過度表達導(dǎo)致細胞內(nèi)源性CyclinD1mR

12、NA表達增高,并且ATF3的這種效應(yīng)是通過結(jié)合到AP-1位點介導(dǎo)的。 CyclinD1是細胞周期調(diào)控中的一個非常重要的因子。真核細胞的增殖調(diào)控發(fā)生在細胞周期的特異性時相。大量的研究證實了CyclinD1是作用于G1期的重要細胞周期蛋白,可以促進G1~S期轉(zhuǎn)換。CyclinD1發(fā)揮功能是通過在細胞周期G1期激活CDK4/6,接著催化了抑癌蛋白pRb的磷酸化失活,從而導(dǎo)致抑制與細胞增殖相關(guān)的E2F等目的基因。這些結(jié)果提示Cyclin

13、D1的過表達和人類腫瘤的發(fā)展有密切關(guān)系。CyclinD1在沒有CDK的參與時還會影響不同的細胞轉(zhuǎn)錄因子的活性(例如雌激素和雄激素的受體)。目前為止,這種特性僅在轉(zhuǎn)染構(gòu)建的報告系統(tǒng)實驗中見到,所以這種所謂的CyclinD1的對內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄活性的提法目前還存有爭議。然而,這些觀察結(jié)果確實暗示著CyclinD1存在另一個非CDK依賴性的生物學(xué)活性。 因此在上述實驗的基礎(chǔ)上,我們觀察了Restin和ATF3的相互作用對CyclinD

14、1的表達的影響。通過打點雜交的技術(shù)和α-32P標(biāo)記的同位素CyclinD1cDNA探針雜交實驗及放射自顯影技術(shù),觀察了在NIH3T3細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染ATF3和Restin基因后CyclinD1的mRNA表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨轉(zhuǎn)染Restin或ATF3表達質(zhì)粒具有輕微的增強CyclinD1mRNA表達的效應(yīng),而在共轉(zhuǎn)染Restin和ATF3表達質(zhì)粒后,CyclinD1mRNA的表達發(fā)生了顯著的增強,因此我們推測:Restin在細胞處于壓力情形下

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