S-烯丙基半胱氨酸激活Nrf2-ARE信號通路對缺血性腦卒中的保護作用研究.pdf

1、研究背景:
　　缺血性腦卒中嚴重危害人類健康，是目前繼心血管病之后的第二大死因。越來越多的研究表明，氧化應激在腦缺血發(fā)病中占據(jù)重要地位，減輕氧化應激反應是腦缺血的一個重要治療策略。
　　Nrf2(nuclear transcription factor NF-E2-related factor2)是調節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)的重要轉錄因子。作為內源性抗氧化防御系統(tǒng)的主要調節(jié)因子，Nrf2能誘導一系列細胞保護基因和解毒基因的表達。在

2、對抗氧化應激損傷方面具有很大潛力。Nrf2轉移入核后可啟動受ARE調控的下游基因如血紅蛋白氧合酶（hemeoxygenase，HO-1）、谷胱甘肽半胱氨酸連接酶催化亞基(glutathionecysteine ligase regulatory subunit，GCLC)、谷胱甘肽半胱氨酸連接酶調節(jié)亞基(glutathione cysteine ligase modulatory subunit，GCLM)等的轉錄，從而保護細胞免受氧化

3、損傷。
　　眾多的證據(jù)表明，Nrf2-ARE(antioxidant response element)通路在缺血/再灌注腦損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，是腦缺血發(fā)生發(fā)展過程中重要的調控靶點。尋找新型高效的Nrf2誘導劑可為腦缺血的治療提供新的有效候選藥物。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，大蒜中含有的有機硫成分S-烯丙基半胱氨酸(S-allylcysteine，SAC)為強Nrf2誘導劑，初步的細胞實驗結果發(fā)現(xiàn)該化合物可保護OGD(oxyg

4、en and glucose deprivation)所致原代皮層神經元氧化應激損傷，且此保護作用與Nrf2-ARE通路誘導密切相關。本研究通過OGD損傷原代皮層神經元模型及C57BL/6小鼠腦缺血模型，分別從體內體外研究該化合物對OGD所致腦缺血細胞及動物模型的保護作用及機制，從抗氧化角度闡明其作用機理。為腦缺血的治療提供一種新策略，為篩選Nrf2-ARE通路誘導劑治療缺血性腦血管疾病提供新思路和途徑。
　　研究目的:
　

5、　研究SAC通過調節(jié)Nrf2-ARE信號通路對缺血性腦損傷的神經保護作用并探討其作用機制。
　　研究方法:
　　體外實驗:
　　1.在原代皮層神經元中給予不同濃度的SAC干預8h和24 h以及選擇50μM的SAC作用于神經元不同時間后，Western blot法檢測Nrf2蛋白表達以及下游蛋白（GCLC，GCLM，HO-1）的表達水平;用電泳遷移率的方法檢測Nrf2-DNA結合活性。觀察SAC是否激活Nrf2-ARE信

6、號通路。
　　2.在原代皮層神經元中給予不同濃度的SAC干預2h后，采用糖氧剝奪(OGD)損傷60 min再灌注24 h。用MTT法檢測細胞存活率，化學顯色法檢測乳酸脫氫酶(LDH)漏出率，Hoechst33258和Tunel染色檢測細胞凋亡水平。觀察SAC對OGD誘導原代皮層神經元損傷的保護作用。用Western blot法檢測凋亡通路各蛋白(p-JNK，p-p38，caspase-3)的表達水平，觀察SAC能否阻斷OGD所致J

7、NK/p38凋亡信號通路的激活。
　　3.shRNA干擾Nrf2表達，然后給予SAC(50μM)干預，8h和24 h后用Western blotting法檢測Nrf2及下游蛋白(HO-1，GCLC，GCLM)的表達水平。檢測Nrf2被干擾后SAC是否還可以激活Nrf2-ARE通路。另外，shRNA干擾Nrf2表達，SAC(50μM)干預2h，OGD損傷60 min，培養(yǎng)24 h后采用MTT法和LDH法檢測細胞的存活率及Hoechs

8、t33258染色觀察細胞發(fā)生凋亡的情況。檢測Nrf2被干預后，SAC的保護作用是否還存在，以驗證SAC的保護作用是否通過激活Nrf2-ARE通路實現(xiàn)。
　　體內實驗:
　　1.野生型小鼠(Nrf2+/+)和Nrf2敲基因小鼠(Nrf2-/-)腹腔注射SAC(300mg/kg)30 min后，MCAO法制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型，再灌注24h后取小鼠腦組織，免疫組化法觀察Nrf2在皮層和海馬中的分布情況;Western b

9、lot法檢測Nrf2和下游蛋白(GCLC，GCLM，HO-1)在皮層和海馬中的表達水平。
　　2.MCAO法制備小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，采用TTC染色法觀察腦梗死面積，神經病學評分觀察小鼠的行為學變化，HE和Nissl染色觀察皮層和海馬神經元的形態(tài)學變化。
　　3.制備MCAO模型前30 min，腹腔注射SAC(300 mg/kg)，缺血再灌注24 h后，將小鼠麻醉處死，取小鼠全腦或皮層和海馬。用TUNEL染色法檢測

10、小鼠皮層和海馬凋亡細胞數(shù)的變化，Western blotting法檢測凋亡信號通路各蛋白(p-JNK，p-p38，caspase-3)表達情況。檢測SAC是否可阻斷MCAO所致JNK/p38凋亡信號通路的激活。
　　實驗結果:
　　1.在原代培養(yǎng)的皮層神經元中SAC可呈劑量和時間相關性的誘導Nrf2蛋白表達，并促進Nrf2下游蛋白(GCLC，GCLM，HO-1)的表達。
　　2.對原代培養(yǎng)的皮層神經元進行OGD損傷后，

11、SAC能夠增加細胞存活率，減少乳酸脫氫酶釋放量，減少凋亡細胞數(shù)目，可阻斷p-JNK，p-p38誘導的細胞凋亡。
　　3.采用shRNA將原代皮層神經元中Nrf2阻斷后，SAC干預組中Nrf2及下游基因（GCLC，GCLM，HO-1）的表達不再升高;SAC的保護作用明顯被阻斷，表明SAC是通過Nrf2依賴的方式來保護神經元免受氧化應激損傷。
　　4.SAC可誘導野生型小鼠（Nrf2+/+）皮層和海馬Nrf2及其下游蛋白(GCL

12、C,GCLM，HO-1)的表達，而對敲基因小鼠（Nrf2-/-）在IR，IR+SAC兩組中Nrf2以及下游蛋白(GCLC，GCLM，HO-1)的表達相對Sham組來說無明顯差異。
　　5.對野生型小鼠（Nrf2+/+）給予SAC后腦梗死面積明顯減少，而對敲基因小鼠(Nrf2-/-)腦梗死面積在IR，IR+SAC兩組無差異且都較野生型小鼠嚴重;野生型小鼠（Nrf2+/+）給予SAC后皮層和海馬中細胞形態(tài)學發(fā)生了明顯改善，而對敲基因小

13、鼠(Nrf2-/-)皮層和海馬部位凋亡細胞數(shù)在IR，1R+SAC兩組無差異且都較野生型小鼠增多。
　　6.在野生型小鼠(Nrf2+/+)中，SAC干預組能明顯減少細胞凋亡數(shù)目以及明顯降低凋亡信號通路各蛋白（p-JNK, p-p38，caspase-3）的表達;而在敲基因小鼠（Nrf2-/-）中SAC的這種保護作用消失。
　　結論:
　　SAC對OGD誘導的原代培養(yǎng)皮層神經元氧化應激損傷以及小鼠腦缺血再灌注損傷具有神經保