分枝桿菌細胞壁相關(guān)毒力基因的分離鑒定和功能研究及噬菌體報告系統(tǒng)在快速檢測結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性中的應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核病是一種對人類健康及社會穩(wěn)定構(gòu)成嚴重威脅的傳染性疾病。在上個世紀中期，隨著各種抗結(jié)核藥物的發(fā)現(xiàn)，人類對于結(jié)核病的控制取得了輝煌的成就。但是隨著耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)及流行，HIV和結(jié)核菌的共感染，結(jié)核病這種“白色瘟疫”又有重新抬頭的趨勢。結(jié)核分枝桿菌獨特的細胞壁上諸多的毒力相關(guān)因子在其致病中起到了重要的作用。篩選出這些毒力相關(guān)因子，闡明其代謝途徑及功能可以幫助我們進一步理解結(jié)核菌的致病機制，為尋求新的治療結(jié)核的手段提供理論基礎(chǔ)。另一方面，

2、傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實驗耗時久，難以對臨床結(jié)核病的治療發(fā)揮及時的指導(dǎo)作用，因此開發(fā)一種廉價但快速的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性檢測方法對指導(dǎo)耐藥結(jié)核病的治療以及控制其傳播具有重要意義。全文分兩部分： 第一部分海分枝桿菌細胞壁毒力相關(guān)基因的分離鑒定及其功能研究因生長相對快速、對人體危害小，海分枝桿菌正越來越多的被作為一種研究致病性分枝桿菌的模型。利用MycoMarT7噬菌體轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，我們建立了海分枝桿菌的隨機突變庫。以細菌在固體

3、培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)改變以及顯微鏡下的索狀結(jié)構(gòu)改變?yōu)闃酥?，篩選出兩個索狀結(jié)構(gòu)突變株——02C4和02C10突變株，其插入失活的基因與結(jié)核分枝桿菌基因ppsA和mas基因高度同源。ppsA和mas均為結(jié)核分枝桿菌細胞壁毒力因子PDIM合成通路上的重要基因。經(jīng)細胞壁脂質(zhì)成分的薄層色譜分析證實該兩株海分枝桿菌突變株細胞壁的PDIM均缺失。我們重點研究了02C10 ⊿mas突變株。02C10 ⊿mas在體外環(huán)境中的生長速度與野生株并無差異，掃描電

4、鏡下微觀結(jié)構(gòu)改變不顯著，但是在巨噬細胞內(nèi)的復(fù)制、繁殖受到抑制，注射入斑馬魚腹腔后對斑馬魚的致死力急劇下降，并且不形成肉芽腫病理改變。因此，PDIM對于海分枝桿菌在巨噬細胞以及宿主體內(nèi)的存活非常重要，這一結(jié)論與結(jié)核菌中研究結(jié)果相一致。本課題利用MycoMarT7噬菌體建立了海分枝桿菌隨機突變庫，以海分枝桿菌為模型篩選出兩個分枝桿菌細胞壁毒力相關(guān)基因，并建立了海分枝桿菌的毒力檢測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)PDIM在海分枝桿菌的致病性中起到重要重要的作用。

5、 第二部分應(yīng)用噬菌體報告系統(tǒng)檢測結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性本研究旨在建立快速檢測結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性的噬菌體報告系統(tǒng)(LRPs)，評估其在檢測異煙肼(INH)，利福平(RFP)，鏈霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)敏感性中的應(yīng)用價值。 應(yīng)用LRPs檢測49株WHO質(zhì)控菌株及57株臨床菌株共計106株轉(zhuǎn)種的新鮮結(jié)核分枝桿菌對四種藥物的敏感性，并與比例法相比較。LRPs與比例法對這四種藥物耐藥檢測的一致率分別為93.4％，96.2

6、％，93.4％和84.9％；以比例法為標準，LRPs對這四種藥物耐藥檢測的敏感度分別為98.0％，96.9％，90.4％和75.0％，特異度分別為89.5％，96.0％，96.3％和87.2％。經(jīng)配對x<'2>檢驗分析，對于轉(zhuǎn)種過的新鮮菌株，LRPs與比例法對四種藥物耐藥的檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。隨后，我們應(yīng)用LRPs直接檢測了157株上海市疾病預(yù)防控制中心收集的痰培養(yǎng)菌株的藥物敏感性。結(jié)果只有39株的LRPs檢測結(jié)果有效，其對INH，R

7、FP，SM和EMB的藥敏檢測結(jié)果與比例法的一致率分別為79.5％，87.2％，97.4％和66.7％。重新轉(zhuǎn)種兩種方法檢測結(jié)果不一致的菌株，再次用LRPs法檢測后，LRPs對IRSE四種藥物的藥敏結(jié)果與比例法的一致率達到了92.3％，94.9％，97.4％和79.5％。 噬菌體報告系統(tǒng)檢測固體培養(yǎng)基上新鮮的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性準確快速、可重復(fù)性強。但是對于上海市疾病預(yù)防控制中心模式下的痰培養(yǎng)標本的直接檢測有效率不高，錯誤較多，