真菌對(duì)三種中藥生長(zhǎng)發(fā)育和有效成分影響的物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、本文從化學(xué)、生理生化及分析等方面較系統(tǒng)研究了兩種真菌(蜜環(huán)菌、AR18號(hào)菌)對(duì)其宿主生長(zhǎng)發(fā)育以及有效成分影響的物質(zhì)基礎(chǔ)，主要包括蜜環(huán)菌菌索的化學(xué)成分研究及其對(duì)豬苓菌絲生長(zhǎng)及豬苓酮類(lèi)成分的影響；蜜環(huán)菌菌索代謝產(chǎn)物對(duì)天麻種子萌發(fā)和發(fā)育的影響；ARl8號(hào)菌化學(xué)成分研究及其對(duì)金線蓮試管苗生長(zhǎng)和黃酮類(lèi)成分的影響。 首次對(duì)天然蜜環(huán)菌菌索的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，運(yùn)用硅膠、凝膠、聚酰胺柱層析等色譜方法結(jié)合質(zhì)譜、核磁共振譜等現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)從蜜環(huán)

2、菌菌索中分離鑒定了13個(gè)單體化合物。主要是三萜和甾體類(lèi)成分，包括三萜類(lèi)化合物4個(gè)，分別是木栓酮，3α-hydroxyfriedel-2-one，3-hydroxyfriedel-3-en-2-one，3β-hydroxyglutin-5-ene：甾體類(lèi)化合物3個(gè)，分別是麥角甾醇，麥角甾醇過(guò)氧化物，6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3p-ol；<口，山>酮類(lèi)化合物1個(gè)，為2-acetyl-1，3，8-trihy-dr

3、oxyxanthone；脂肪酸類(lèi)化合物3個(gè)，分別是十八烷酸，十八烷酸甲酯，二十四烷酸；小分子糖2個(gè)，分別是葡萄糖，甘露醇。其中3個(gè)為首次從真菌中分得，1個(gè)為首次從天然產(chǎn)物中分離。6個(gè)為從本屬中首次分得。首次對(duì)3α-hydroxyfriedel-2-one，3-hydroxyfriedel-3-en-2-one，6,9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3β-01的氫譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了全歸屬。 為尋找蜜環(huán)菌菌索中促進(jìn)豬苓生

4、長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，應(yīng)用真菌平板培養(yǎng)和HPLC等方法，系統(tǒng)研究了蜜環(huán)菌代謝產(chǎn)物對(duì)豬苓菌絲生長(zhǎng)及豬苓酮類(lèi)成分的影響。研究結(jié)果表明，蜜環(huán)菌菌索水提取物可以為豬苓菌絲生長(zhǎng)提供碳源和氮源：蜜環(huán)菌菌索甲醇提取物對(duì)豬苓菌絲生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，在培養(yǎng)末期豬苓菌落直徑最大可以較對(duì)照提高13.5％；蜜環(huán)菌甲醇提取物的4個(gè)不同極性部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位)中石油醚部位對(duì)豬苓促生長(zhǎng)效果最顯著，培養(yǎng)末期豬苓菌落直徑較對(duì)照提高了26.4％

5、；分離自石油醚部位的單體化合物Am4對(duì)豬苓菌絲生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，特別是在豬苓生長(zhǎng)的初期有顯著的促生長(zhǎng)作用，表明Am4可能是蜜環(huán)菌促進(jìn)豬苓生長(zhǎng)活性物質(zhì)的組成部分。來(lái)自蜜環(huán)菌的各誘導(dǎo)子都促進(jìn)了豬苓菌絲中豬苓酮類(lèi)成分的產(chǎn)生或積累。且這種誘導(dǎo)作用隨著誘導(dǎo)子成分的復(fù)雜化而加強(qiáng)，其中以蜜環(huán)菌菌索甲醇提取物的石油醚部位誘導(dǎo)的豬苓酮類(lèi)成分最多，共可誘導(dǎo)14個(gè)。 為尋找蜜環(huán)菌菌索中抑制天麻種子萌發(fā)及促進(jìn)天麻營(yíng)養(yǎng)繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，應(yīng)用組織培養(yǎng)、顯

6、微觀察等方法研究了蜜環(huán)菌代謝產(chǎn)物對(duì)天麻種子萌發(fā)和發(fā)育的影響。研究結(jié)果表明，蜜環(huán)菌菌索中抑制天麻種子萌發(fā)的主要物質(zhì)存在于極性大的水提取物中。來(lái)源于水提取物的上清液和蜜環(huán)菌多糖對(duì)天麻種子萌發(fā)的抑制作用與水提取物的作用相似，都延遲了天麻種子萌發(fā)的起始時(shí)間，降低了天麻種子萌發(fā)率，并且都隨著濃度的增加，抑制作用逐漸加強(qiáng)，其中蜜環(huán)菌多糖的抑制效果最明顯。蜜環(huán)菌甲醇提取物盡管對(duì)天麻種子萌發(fā)有一定的抑制作用，但有利于天麻的營(yíng)養(yǎng)繁殖。進(jìn)一步的研究表明，從

7、蜜環(huán)菌甲醇提取物中獲得的單體化合物麥角甾醇可以促進(jìn)天麻種子的萌發(fā)并促進(jìn)天麻原球莖的營(yíng)養(yǎng)繁殖，麥角甾醇處理天麻原球莖的最高分化率為87.0％。 為尋找AR18號(hào)菌促進(jìn)金線蓮生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，系統(tǒng)研究了ARl8號(hào)菌的化學(xué)成分及其對(duì)金線蓮試管苗生長(zhǎng)及黃酮類(lèi)成分的影響。 成功地在2噸發(fā)酵罐中進(jìn)行了AR18號(hào)菌的深層液體發(fā)酵中試，并首次對(duì)AR18號(hào)菌(一種瘤菌根菌屬的真菌)的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究。運(yùn)用硅膠、凝膠、聚酰胺柱層析等色譜

8、方法從AR18號(hào)菌中共分得單體化合物35個(gè)，綜合應(yīng)用質(zhì)譜、核磁共振譜等現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)鑒定了其中33個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，包括甾體類(lèi)化合物8個(gè)，分別為麥角甾醇、麥角甾烯氧化物、麥角甾醇過(guò)氧化物、5α，6a-epoxy-24(R)-methylcholesta-7，22-dien-3β-ol、β-谷甾醇、豆甾醇、(22E，24R)-24-methyl-cholesta-5，22-dien-3β-ol、(24S)-24-methyl-5α-chol

9、estan-3β-ol；黃酮類(lèi)化合物2個(gè)，分別為5,7-二羥基-6-甲氧基黃酮、5,6,7-三羥基黃酮；葸醌類(lèi)化合物一個(gè)，為大黃素甲醚；核苷及其類(lèi)似化合物6個(gè)，分別為腺嘌呤核苷、胸腺嘧啶、尿嘧啶核苷、2-羥基-4-氧-3,4,5,6-四氫嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤核苷、核黃素；環(huán)肽類(lèi)化合物2個(gè)，分別為吡咯駢<'[1，2a]>3，6-二酮六氫吡嗪、(3R,8aR)-Hexahydro-3-(2-methylpropyl)pyrrolo[1，2a]pyr

10、azine-1，4-dione；小分子化合物8個(gè)，分別為3-羧基吲哚、4,4-二甲基-1，7-庚二酸、4’-羥基苯乙醇、4’-羥基苯乙酸、琥珀酸、丙二酸、琥珀酸甲酯、5-羥甲基糠醛；含脂肪族類(lèi)化合物4個(gè)，分別為α-棕櫚精、5-二十五烷基-1，3-苯二酚、二十烷酸甲酯、2,4-十五二烯；小分子糖2個(gè)，分別為D-甘露醇、葡萄糖。以上化合物均為從該屬真菌中首次分得。 應(yīng)用組織培養(yǎng)和HPLC等方法研究了AR18號(hào)菌代謝產(chǎn)物對(duì)金線蓮試管苗

11、生長(zhǎng)及黃酮類(lèi)成分的影響。研究結(jié)果表明：AR18號(hào)菌的發(fā)酵液乙醇提取物和菌絲體乙醇提取物對(duì)金線蓮生長(zhǎng)都有明顯的促進(jìn)作用，分別可以使金線蓮的鮮重增加倍數(shù)較對(duì)照提高24.5％和14.6％，使金線蓮的干重增加倍數(shù)較對(duì)照提高29.9％和15.9％，而且這兩個(gè)誘導(dǎo)子都有利于金線蓮黃酮類(lèi)成分的積累。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AR18號(hào)菌促進(jìn)金線蓮生長(zhǎng)的活性成分主要存在于發(fā)酵液乙醇提取物的乙酸乙酯部位和菌絲體乙醇提取物的正丁醇部位，這兩個(gè)部位分別可以使金線蓮的鮮重

12、增加倍數(shù)較對(duì)照提高38.3％和3 1.8％；使金線蓮的干重增加倍數(shù)較對(duì)照提高59.1％和37.4％。 通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)對(duì)上述兩個(gè)部位分離得到的單體化合物進(jìn)行金線蓮試管苗促生長(zhǎng)活性的篩選，發(fā)現(xiàn)化合物AR7和ARlO可以顯著提高金線蓮試管苗的鮮重增加倍數(shù)和干重增加倍數(shù)，分別可以使金線蓮的鮮重增加倍數(shù)較對(duì)照提高20.4％和17.5％，使金線蓮的干重增加倍數(shù)較對(duì)照提高23.0％和21.0％，且這兩個(gè)化合物對(duì)金線蓮黃酮類(lèi)成分影響不

13、大。AR7在發(fā)酵液乙醇提取物的乙酸乙酯部位和菌絲體乙醇提取物的正丁醇部位中都有存在，該化合物可能是AR18號(hào)真菌促進(jìn)金線蓮生長(zhǎng)的活性物質(zhì)之一。 AR18號(hào)菌代謝產(chǎn)物對(duì)金線蓮試管苗黃酮類(lèi)成分的種類(lèi)沒(méi)有影響，但對(duì)含量影響較大。誘導(dǎo)子的種類(lèi)、濃度對(duì)不同的黃酮類(lèi)成分誘導(dǎo)效果不同，AR18號(hào)菌發(fā)酵液和菌絲體提取物處理都能提高6種黃酮總含量，主要提高了fla-3的含量，最高達(dá)到對(duì)照的18倍。發(fā)酵液提取物乙酸乙酯部位處理的金線蓮中6種黃酮含量均高于對(duì)

14、照，且隨著誘導(dǎo)子濃度的增加，各黃酮含量也呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵液提取物的石油醚、正丁醇、水部位處理金線蓮6種黃酮總含量都與對(duì)照接近，對(duì)各黃酮類(lèi)成分的影響也不相同。但發(fā)酵液的4個(gè)極性部位都提高了fla-5含量，以水部位處理的作用效果最明顯，可以達(dá)到對(duì)照的5.15倍。 菌絲體提取物石油醚部位能降低金線蓮中已知黃酮類(lèi)成分總含量，尤以對(duì)fla-3的含量影響明顯，僅為對(duì)照的24％；菌絲體提取物乙酸乙酯、水部位處理的金線蓮中6種已知黃酮總含量與對(duì)