DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)與輻射劑量關(guān)系的研究——基于納米生物探針DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白檢測(cè)方法的建立.pdf

1、準(zhǔn)確快速測(cè)定人員吸收劑量在放射傷員的分類(lèi)診斷和臨床治療、腫瘤患者的精準(zhǔn)化和人性化放射治療、放射生物學(xué)效應(yīng)研究、特殊輻射環(huán)境人員健康危害評(píng)價(jià)等領(lǐng)域都有重要作用和意義，是當(dāng)今放射醫(yī)學(xué)和輻射防護(hù)學(xué)研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容。
　　 物理方法測(cè)定輻射場(chǎng)劑量和個(gè)體的吸收劑量直接而準(zhǔn)確，具有權(quán)威性。但在未佩帶個(gè)人劑量計(jì)和未安裝現(xiàn)場(chǎng)劑量監(jiān)測(cè)計(jì)等情況下，用物理方法檢測(cè)劑量十分艱難，這不僅因?yàn)闇?zhǔn)確檢測(cè)需要花大量時(shí)間重建輻射現(xiàn)場(chǎng)，更因?yàn)橛袝r(shí)輻射現(xiàn)場(chǎng)根本無(wú)法

2、模擬和重建。因此，在一些特殊或突發(fā)情況，用物理方法檢測(cè)人員受照劑量很難做到。
　　 用生物分析的方法來(lái)評(píng)估人員受照劑量雖有許多優(yōu)勢(shì)，是未來(lái)發(fā)展的方向，但仍存在許多待解決的科學(xué)和技術(shù)問(wèn)題，問(wèn)題的關(guān)鍵在于如何篩選出敏感、特異能反映生物受照劑量的一系列生物指標(biāo)，及在此基礎(chǔ)上建立準(zhǔn)確可靠、靈敏快速的分析方法技術(shù)。隨著新理論、新方法和新技術(shù)的運(yùn)用，一些在基因和蛋白水平具有發(fā)展?jié)摿Φ男律飫┝繕?biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。以ATM蛋白為代表的DN

3、A損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的含量和活化程度的改變與輻射劑量間的量效關(guān)系就是目前研究的熱點(diǎn)之一。ATM(Ataxia Telangiectasia Mutated)是一種在感應(yīng)和傳遞DNA損傷信號(hào)、啟動(dòng)損傷DNA修復(fù)中起著重要作用的蛋白，其活化程度與DNA損傷程度存在依賴關(guān)系，當(dāng)發(fā)生DNA損傷時(shí)，ATM蛋白自身被磷酸化，同時(shí)激活并調(diào)節(jié)一系列與DNA修復(fù)相關(guān)的蛋白，包括H2AX，RAD50，NBS1，Mre11，CHk1、2，c-AB1等，導(dǎo)致這些

4、重要功能蛋白聚集在DNA損傷和斷裂的部位，實(shí)現(xiàn)與DNA損傷部位的連接，使修復(fù)順利進(jìn)行。文獻(xiàn)報(bào)道0.25Gy照射后30分鐘即可見(jiàn)ATM蛋白的活化信號(hào)，4Gy照射后3小時(shí)仍可檢測(cè)到較高強(qiáng)度的ATM蛋白活化熒光灶(foci)。然而，過(guò)去檢測(cè)ATM活化大都采用免疫熒光的方法直接對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白進(jìn)行染色分析，此方法雖直觀，但需要通過(guò)大量細(xì)胞觀察并對(duì)其熒光強(qiáng)度進(jìn)行識(shí)別和統(tǒng)計(jì)才能對(duì)ATM活化量進(jìn)行半定量檢測(cè)，這種方法難以實(shí)現(xiàn)對(duì)輻射劑量的準(zhǔn)確快速定量分析

5、，尤其是在低照射劑量范圍蛋白活化信號(hào)較弱的場(chǎng)合。因此，針對(duì)ATM等蛋白檢測(cè)在生物劑量計(jì)研究中的應(yīng)用，需要一種能直接定量和靈敏特異的檢測(cè)方法。生物傳感器是近年來(lái)發(fā)展較快的一種特異、靈敏的生物分子檢測(cè)技術(shù)，納米材料因其良好的生物相容性和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)在DNA傳感器等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
　　 本研究以化學(xué)或生物修飾的納米材料為載體，以醛基磁珠表面修飾的ATM單抗捕獲樣品中的ATM抗原，通過(guò)在反應(yīng)體系中加入ATM多抗形成單抗-抗原

6、一多抗的夾心結(jié)構(gòu)，通過(guò)納米生物探針實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大輸出，建立可對(duì)溶質(zhì)中fg量級(jí)ATM蛋白進(jìn)行靈敏、特異檢測(cè)的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的靈敏、特異檢測(cè)。與傳統(tǒng)方法比，這種檢測(cè)方案有可能使受評(píng)估的劑量范圍更低。由于不同探針設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的方法不同，各有利弊，本研究在對(duì)一系列納米生物探針，如IgG-納米金-DNA探針，IgG-納米金-HRP探針，摸索篩選的基礎(chǔ)上尋找史簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定可靠的檢測(cè)策略-IgG-納米碳管-HRP探針。
　　 研究?jī)?nèi)容<

7、br>　　 根據(jù)篩選探針的不同，主要研究?jī)?nèi)容分為三部分：
　　 一、基于IgG-納米金-HRP探針的方法檢測(cè)ATM蛋白
　　 二、基于IgG-納米碳管-HRP探針的方法檢測(cè)ATM蛋白
　　 三、基于IgG-納米金-DNA探針的RCA方法
　　 研究步驟
　　 一、納米金和納米碳管探針的制備
　　 分別調(diào)節(jié)納米金溶液的PH致所加蛋白的等電點(diǎn)附近和將納米碳管表面的羧基用EDC和NHS活化，將

8、0.005mg/ml的IgG和1mg/ml的HRP分別加入到準(zhǔn)備好的納米金或納米碳管中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，BSA封閉，離心洗滌去掉未結(jié)合反應(yīng)的蛋白，用儲(chǔ)存液(0.5％casein)重懸沉淀即為納米探針。
　　 二、制備探針的驗(yàn)證
　　 在包被有ATM蛋白的多克隆抗體的醛基磁珠體系中加入制備的探針，通過(guò)檢測(cè)探針上的二抗和磁珠上的多抗是否發(fā)生特異性顯色反應(yīng)，驗(yàn)證探針表面兩種蛋白連接的成敗和生物活性。
　　 三、利用探針檢

9、測(cè)目標(biāo)蛋白
　　 將ATM單克隆抗體加入到醛基化磁珠中，25℃下孵育1h，洗滌除去游離蛋白，加入封閉液37℃反應(yīng)1h，封閉醛基磁珠表面可能存在的空白活性位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，PBST(150mMPBS,0.25％Tween20)洗滌3min×2次，加入ATM抗原溶液至蛋白標(biāo)記的磁珠溶液中，37℃輕微振蕩反應(yīng)1h。PBST洗滌3min×2次，然后各加入ATM多克隆抗體，37℃下輕微振蕩反應(yīng)1h。PBST洗滌3min×2次，加入制備好的

10、探針溶液，37℃下再次孵育1h，實(shí)現(xiàn)抗原抗體的免疫反應(yīng)連接。結(jié)束后，PBST洗滌3min×4次，加入TMB(含H2O2)室溫孵育2～3min，變色完全并穩(wěn)定后，酶標(biāo)儀測(cè)光吸收值，收集數(shù)據(jù)并分析。
　　 四、數(shù)據(jù)處理
　　 用SPSS11.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，一維方差分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(以P＜0.05為差異顯著)。利用origi8.0制作各圖表。方法檢測(cè)限的確定標(biāo)準(zhǔn)為將陰性對(duì)照均值加上三倍陰性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)偏差設(shè)為閾

11、值，信號(hào)高于此值的濃度即為該方法的最低檢測(cè)限。方法的特異性從實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組信號(hào)差別的量級(jí)上體現(xiàn)。
　　 本研究的初步結(jié)果：
　　 制備出IgG-納米金-DNA探針，IgG-納米金-HRP探針和IgG-納米碳管-HRP探針三種具有生物活性的納米生物探針，經(jīng)比較分析納米碳管生物探針基本能滿足標(biāo)準(zhǔn)體系中對(duì)ATM蛋白特異、靈敏和可重復(fù)性的檢測(cè)。
　　 初步結(jié)論：
　　 與檢測(cè)蛋白的經(jīng)典ELISA方法和其他生物