小白菊內(nèi)酯對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的實(shí)驗研究.pdf

1、第一部分小白菊內(nèi)酯對枯否細(xì)胞分泌功能的影響。
　　 目的：研究小白菊內(nèi)酯對枯否細(xì)胞釋放炎性因子的影響并闡明其作用機(jī)制。
　　 方法：采用膠原酶原位灌注法分離及提純枯否細(xì)胞。將細(xì)胞分為3組：A組為對照組(Control group)，培養(yǎng)正常大鼠KCs；B組為LPS刺激組(LPS group)，在開始培養(yǎng)KCs時，培養(yǎng)液中加入終濃度為10mg/lLPS；C組為LPS+PTN組(PTN group)，培養(yǎng)液中先加入5μmol

2、/l PTN培養(yǎng)1h，然后再加入10mg/l LPS。各組分別于培養(yǎng)3h后獲取標(biāo)本作相應(yīng)指標(biāo)檢測，重復(fù)8次實(shí)驗后取其均值(n=8)。將各組細(xì)胞置于倒置的顯微鏡下觀察其形態(tài)變化，臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗判斷細(xì)胞活力，抗ED-2免疫組化染色檢測純度，ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-1和TNF-α的水平，EMSA法檢測NF-κB DNA結(jié)合活性。
　　 結(jié)果：新分離的KCs在倒置的顯微鏡下呈球形，懸浮于培養(yǎng)基中；約6h后，大部分細(xì)胞貼壁呈扁圓

3、形，少數(shù)細(xì)胞伸出偽足；24h后大部分細(xì)胞伸出偽足，呈典型星形和多角形，細(xì)胞體積明顯變大；各組枯否細(xì)胞分離純度均為>90％，活性>96％。與A組比較，B組IL-1和TNF-α水平明顯增高(P<0.05)；與B組比較，C兩組IL-1和TNF-α水平明顯較低(P<0.05)；與A組比較，B組NF-κB DNA結(jié)合活性顯著增高(P<0.05)；與B組比較，C組NF-κB DNA結(jié)合活性顯著降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　

4、 1、在LPS的刺激下，肝臟枯否細(xì)胞活化而釋放大量炎性因子；
　　 2、小白菊內(nèi)酯可能通過下調(diào)NF-κB活性，抑制肝臟枯否細(xì)胞的活化，減少炎性因子的大量釋放。
　　 第二部分小白菊內(nèi)酯對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的作用。
　　 目的：研究小白菊內(nèi)酯在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組(n=18)：假手術(shù)組(A)、對照組(B)、小白菊內(nèi)酯小劑量干預(yù)組(C)

5、和小白菊內(nèi)酯大劑量干預(yù)組(D)。缺血前10min分別給予小劑量干預(yù)組和大劑量干預(yù)組大鼠腹腔注射250和500μg/kg的小白菊內(nèi)酯，建立肝左、中葉70％部分肝缺血再灌注模型，假手術(shù)組給予同樣體積的0.1％DMSO。肝臟缺血90min后對缺血肝葉進(jìn)行再灌注，分別于再灌注后2、6、24h收集血液及缺血肝葉組織標(biāo)本，每個時點(diǎn)n=6。檢測血清ALT、AST水平，肝組織HE染色后置光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)變化，并根據(jù)Suzuki’s評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理損

6、傷半定量評分，ELISA檢測肝組織中MPO活力和MDA含量檢測。
　　 結(jié)果：與對照組相比，小劑量和大劑量小白菊內(nèi)酯干預(yù)組血清ALT、AST水平均明顯下降(P<0.05)，大劑量干預(yù)組較小劑量組更明顯(P<0.05)；與對照組相比，小白菊內(nèi)酯干預(yù)后肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)明顯改善，Suzuki’s評分明顯降低(P<0.05)，大劑量干預(yù)組較小劑量組更明顯(P<0.05)；小白菊內(nèi)酯干預(yù)后肝組織MPO活力和MDA含量較對照組明顯下降(P

7、<0.05)，大劑量干預(yù)組較小劑量干預(yù)組更明顯(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、小白菊內(nèi)酯干預(yù)能有效改善大鼠肝臟缺血再灌注損傷引起的肝功能和肝臟病理損害；
　　 2、小白菊內(nèi)酯能抑制氧自由基的損傷作用，減輕脂質(zhì)過氧化引發(fā)的組織損傷；
　　 3、小白菊內(nèi)酯干預(yù)能夠減少大鼠肝臟缺血再灌注損傷后中性粒細(xì)胞的聚集浸潤和活化，從而減輕炎癥反應(yīng)。
　　 第三部分小白菊內(nèi)酯在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中對

8、IKK/NF-κB信號通路的影響。
　　 目的：通過觀察小白菊內(nèi)酯對肝臟缺血再灌注損傷中IKK/NF-κB信號通路的影響，探討其缺血再灌注保護(hù)作用的分子機(jī)制。
　　 方法：將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組(n=6)：假手術(shù)組(A)、對照組(B)、小白菊內(nèi)酯干預(yù)組(C)。缺血前10min給予小白菊內(nèi)酯干預(yù)組大鼠腹腔注射5000μg/kg的小白菊內(nèi)酯，建立肝左、中葉70％部分肝缺血再灌注模型，假手術(shù)組給予同樣體積的0.1％DM

9、SO。肝臟缺血90min后對缺血肝葉進(jìn)行再灌注，于再灌注后6h收集血液及缺血肝葉組織標(biāo)本。ELISA檢測血清中TNF-α、ICAM-1及MIP-2水平；RT-PCR檢測肝組織TNF-α、ICAM-1及MIP-2 mRNA的表達(dá)；EMSA法檢測肝組織NF-κB DNA結(jié)合活性；Werstern blotting測定肝組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65和肝組織中p-IKKser180/βser181和IκBα蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：與

10、對照組(B)比較，小白菊內(nèi)酯干預(yù)后血清TNF-α、ICAM-1及MIP-2水平和肝組織TNF-α、ICAM-1及MIP-2 mRNA的表達(dá)均明顯下降(P<0.05)；與對照組(B)比較，小白菊內(nèi)酯干預(yù)組(B)肝組織NF-κB DNA結(jié)合活性和肝組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白及肝臟組織p-IKKser180/βser181蛋白水平較對照組(B)顯著降低(P<0.05)，肝臟組織IκBα含量明顯升高(P<0.05)。
　　 結(jié)論

11、：
　　 小白菊內(nèi)酯可能通過抑制IKK/NF-κB信號通路減少肝臟缺血再灌注損傷中炎性相關(guān)基因和蛋白表達(dá)。
　　 第四部分 JAK2/STAT3信號通路在大鼠肝臟缺血再灌注損傷的作用及小白菊內(nèi)酯對JAK2/STAT3信號通路的影響。
　　 目的：探討JAK/STAT信號通路在肝臟缺血再灌注損傷中的活化規(guī)律及作用機(jī)制，并觀察小白菊內(nèi)酯對JAK2/STAT3信號通路的影響，深入探討其對缺血再灌注保護(hù)作用的分子機(jī)制。<

12、br>　　 方法：將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組(n=6)：假手術(shù)組(A)、對照組(B)、AG490干預(yù)組(C)、小白菊內(nèi)酯干預(yù)組(D)。缺血前10min分別給予AG490干預(yù)組大鼠腹腔注射500μg/kg的AG4901mg/kg和小白菊內(nèi)酯干預(yù)組大鼠腹腔注射500μg/kg的小白菊內(nèi)酯，建立肝左、中葉70％部分肝缺血再灌注模型，假手術(shù)組給予同樣體積的0.1％DMSO。肝臟缺血90min后對缺血肝葉進(jìn)行再灌注，于再灌注后6h收集血液及

13、缺血肝葉組織標(biāo)本。免疫組織化學(xué)染色和Wersternblotting檢測p-JAk2和p-STAT3蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測肝組織TNF-αmRNA的表達(dá)；ELISA檢測血清中TNF-α水平。
　　 結(jié)果：與假手術(shù)組(A)比較，對照組(B)肝組織p-JAk2和p-STAT3蛋白水平和TNF-αmRNA的表達(dá)水平及血清中TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與對照組(B)比較，AG490干預(yù)組(C)肝組織p-JAk2和p-ST

14、AT3蛋白水平和TNF-αmRNA的表達(dá)水平及血清中TNF-α水平明顯降低(P<0.05)；與對照組(B)比較，小白菊內(nèi)酯干預(yù)組(D)肝組織p-JAk2和p-STAT3蛋白水平和TNF-αmRNA的表達(dá)水平及血清中TNF-α水平明顯降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、JAK2/STAT3信號通路在肝臟缺血再灌注損傷中激活；
　　 2、阻斷JAK2/STAT3信號通路的異常激活可能抑制肝臟缺血再灌注損傷