基于受體—配體空間構象信息設計IL-6拮抗多肽.pdf

1、自從1997年William等通過X射線晶體衍射分析確定了人IL-6的三維結構以來，人們在人IL-6及其受體拮抗劑的研究方面已經(jīng)取得了一定成果，但因其特異性差，且不能安全、長期、有效地抑制體內(nèi)IL-6的活性，所以限制了它們在臨床上的應用。本研究擬根據(jù)IL-6/sIL-6R/gp130相互作用復合物的三維結構，通過距離幾何學、分子間氫鍵形成理論探討IL-6與其受體(IL-6R、gp130)的作用模式，借助虛擬篩選與計算機輔助合理設計相結合

2、的方法，合理篩選獲得IL-6小分子拮抗肽，初步建立基于受體—配體相互作用空間構象設計配體拮抗劑的可行性方案。同時，針對設計的IL-6小分子拮抗肽，從實驗上對合成短肽的體外生物學活性進行了評價，希望為臨床治療IL-6相關疾病提供更有效的先導化合物。研究內(nèi)容具體如下： 一.IL-6小分子拮抗肽的設計 根據(jù)IL-6/sIL-6R/gp130相互作用復合物的三維結構，通過計算機圖形學技術、距離幾何學、分子問氫鍵作用確定hIL-6

3、/hIL-6R/gp130相互作用的功能域，理論分析影響配基—受體作用的功能域結構信息及其作用模式。利用位點連接法計算機輔助設計hIL-6拮抗肽，從頭搭建拮抗肽空間構象，經(jīng)分子力學、動力學優(yōu)化獲得的拮抗肽穩(wěn)定構象與受體IL-6R進行分子對接，從理論上構建拮抗肽/hIL-6R相互作用復合物空間結構并對IL-6拮抗肽進行生物學功能評價。 二、IL-6小分子拮抗肽生物學功能評價 ①通過MTT法、3H-TdR摻入法初步驗證IL-

4、6小分子拮抗肽的活性。選擇IL-6依賴型細胞系—人多發(fā)性骨髓瘤細胞XG-7通過細胞學方法檢測拮抗肽對其增殖的影響，進而評價其對IL-6活性的影響。結果表明，設計的IL-6小分子拮抗肽能夠有效抑制IL-6對XG-7細胞的增殖促進作用，顯示拮抗肽在細胞水平能夠較好地抑制IL-6的生物學活性。 ②通過BindingAssay法檢測了IL-6小分子拮抗肽對IL-6與IL-6R的競爭抑制效應。結果表明，IL-6小分子拮抗肽能夠特異性抑制I

5、L-6/sIL-6R的結合。 ③通過流式細胞術分析IL-6小分子拮抗肽對細胞凋亡和細胞周期的影響。選擇XG-7細胞，當IL-6在濃度為2ng/ml時即可使其增殖達到頂峰，而IL-6不存在時細胞將產(chǎn)生凋亡。將不同濃度的短肽作用于細胞，分析其不同劑量對XG-7細胞細胞周期的影響。結果表明，隨著IL-6拮抗肽濃度的逐漸升高，細胞增殖逐漸減少，細胞凋亡比例逐漸增加，說明此拮抗肽在一定程度上能夠拮抗IL-6的生物學活性。 ④通過免

6、疫組化染色法分析IL-6小分子拮抗肽對IL-6細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的影響。將不同濃度的IL-6拮抗肽作用于人肝癌細胞系HepG2細胞后，利用IL-6誘導細胞，通過APAAP方法對其進行免疫組化染色分析。結果表明，隨著肽溶液濃度的升高，細胞染色的數(shù)量逐漸減少，染色強度逐漸減弱，提示IL-6拮抗肽能夠通過阻遏細胞內(nèi)gp130的JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導通路來抑制IL-6的生物學活性。 本文的研究表明，基于IL-6/IL-6R/gp130復合