造血祖細胞促人大腸癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 結(jié)直腸癌（colorectalcarcinoma,CRC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程，每一階段都受多種基因/蛋白的調(diào)控，其中腫瘤細胞運動行為的改變和運動能力的增強是其侵襲和轉(zhuǎn)移所必不可少的。因此，尋找有效、特異的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并探討其功能，不僅有利于闡明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機理，還能為臨床診治、藥物

2、篩選及預(yù)后判斷提供新的靶點。腫瘤細胞和宿主之間的相互作用是腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在因素，腫瘤細胞轉(zhuǎn)移具有一定的器官傾向性，這可能是瘤細胞與特定的器官微環(huán)境相互作用的結(jié)果。腫瘤轉(zhuǎn)移取決于腫瘤細胞本身的分子特性和其分泌的因子對周圍間質(zhì)細胞的影響，包括血管、結(jié)締組織和免疫細胞等。特殊的腫瘤微環(huán)境通過各種調(diào)節(jié)機制影響著腫瘤細胞的生長發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。因此，腫瘤轉(zhuǎn)移不只是腫瘤細胞本身的生物學(xué)特性及遺傳特性所決定，從根本上說是癌細胞與宿主相互作用的結(jié)果，宿

3、主甚至起決定性作用。
　　 造血祖細胞(hematopoieticprogenitorcell，HPC)是造血組織具有自我復(fù)制和分化潛能的原始細胞。對祖細胞表面標(biāo)志性抗原的初步研究發(fā)現(xiàn)，CD133+細胞較CD34+細胞具有更強的增殖潛能且包含有更高比例的長期培養(yǎng)起始細胞，在正常骨髓微環(huán)境條件下CD133+細胞可能比CD34+細胞具有更強的趨化和遷移能力，CD133+造血祖細胞可能代表了更原始的造血細胞。臍血或稱臍帶血，是指嬰兒娩

4、出后，殘留在臍帶和胎盤絨毛血管內(nèi)的血液。臍血中的造血祖細胞的抗原性較弱;增殖能力強;移植相關(guān)的并發(fā)癥的發(fā)生率較骨髓和外周血低，且癥狀輕;采集保存容易;對供者無任何傷害。因此臍血被認(rèn)為是極具潛力的新的造血祖細胞來源。
　　 造血祖細胞能夠通過不同的機制動員進入血液循環(huán)，在外周器官組織修復(fù)、再生及腫瘤生長等生理和病理過程中均發(fā)揮重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)骨髓來源細胞對于腫瘤血管生成、淋巴管生成及腫瘤間質(zhì)形成、甚或腫瘤的發(fā)生均有著密不可分的

5、關(guān)系。又有在動物腫瘤層次的研究初步證實其在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。VEGFR-1+HPC在腫瘤細胞到達特定器官前提前到達，并為腫瘤細胞的到達以及生長創(chuàng)造一個適宜的微環(huán)境即“轉(zhuǎn)移前微生境”。該觀點改變了我們對腫瘤轉(zhuǎn)移的傳統(tǒng)認(rèn)識，使我們認(rèn)識到腫瘤轉(zhuǎn)移不僅僅是腫瘤細胞本身的作用，還包含正常的骨髓起源細胞的再生與聚集。但造血祖細胞在人實體腫瘤的主要作用及機制仍不十分清楚，目前尚未在人類腫瘤模型上得到進一步的證實。
　　 本研究重

6、點探討CD133+臍血造血祖細胞對低、中、高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細胞HCT-116、HT-29、LOVO的體外生存、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響。且通過裸鼠體內(nèi)原位移植實驗探討CD133+造血祖細胞對低轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞SW480EGFP+體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。通過體外和裸鼠體內(nèi)實驗闡明CD133+造血祖細胞在不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中的主要生物學(xué)功能，為揭示結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機制奠定研究基礎(chǔ)，為大腸癌轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療奠定理論基礎(chǔ)。

7、r>　　 研究方法
　　 1、CD133+臍血造血祖細胞的干性維持培養(yǎng)及鑒定
　　 由南方醫(yī)院婦產(chǎn)科提供新鮮臍血標(biāo)本16例，在臍血采集后4h內(nèi)，利用人CD133+免疫磁珠分選系統(tǒng)，分離出CD133+造血祖細胞，予流式細胞儀分析。采用牛血清白蛋白(BSA)和SCF、TPO、IL-3、IL-6、Flt3Ligand五種細胞因子按10∶2.5:1:1:1:1的比例組合的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞8周后，再次予細胞形態(tài)學(xué)、流式細胞儀、免疫

8、細胞化學(xué)染色及免疫熒光技術(shù)鑒定細胞的干性。
　　 2、CD133+臍血造血祖細胞對不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌細胞中MAP4K4的表達和生物學(xué)特性的影響
　　 將CD133+臍血造血祖細胞分別與低、中、高轉(zhuǎn)移潛能的大腸癌細胞HCT-116、HT-29和LOVO均按1:20比例進行直接共趨化培養(yǎng)，通過MTT細胞體外增殖實驗和平板克隆形成實驗檢測CD133+臍血造血祖細胞對不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞增殖能力的影響;通過細胞基質(zhì)粘附實驗檢

9、測CD133+臍血造血祖細胞對不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞粘附能力的影響;用劃痕實驗檢測CD133+臍血造血祖細胞對不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞遷移愈合能力的影響;用Transwell小室法檢測CD133+臍血造血祖細胞對不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響;用熒光定量PCR實驗和Westernblot實驗檢測CD133+臍血造血祖細胞對不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞中腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4(MAP4K4)表達的影響。

10、最后我們觀察并比較CD133+造血祖細胞作用前后不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞體外增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化。
　　 3、應(yīng)用整體可視化人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移動物模型觀察共移植效應(yīng)
　　 利用穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的結(jié)腸癌細胞株SW480/EGFP+，通過皮下成瘤和原位移植方法建立人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移動物模型。利用腫瘤細胞穩(wěn)定表達EGFP的特點，應(yīng)用整體可視化動物模型和病理

11、學(xué)技術(shù)分別對單獨移植和共移植組的人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移動物模型進行評價和鑒定，從而檢測CD133+臍血造血祖細胞對低轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細胞SW480/EGFP+成瘤及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 研究結(jié)果
　　 1、CD133+臍血造血祖細胞的干性維持培養(yǎng)及鑒定
　　 由南方醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，臍血標(biāo)本共16份（其中15份成功提取新鮮細胞，1份失敗），35～50ml/份，8％枸櫞酸抗凝，經(jīng)產(chǎn)婦和家屬同意取自足月健康順產(chǎn)新生兒，新

12、鮮臍血采集后4h內(nèi)，免疫磁珠法分離出CD133+造血祖細胞。從新鮮的臍血中得到的單個核細胞數(shù)平均為（1.82±0.15）×107/ml，經(jīng)CD133磁珠分離系統(tǒng)分離得CD133+富集細胞的平均數(shù)為（1.66±0.01）×105/ml，新鮮臍血單個核細胞中的CD133+細胞所占比例為（0.8±0.01）％，經(jīng)流式細胞儀分析，CD133+細胞純度達到85％以上，CD133+CD34+細胞純度達到80％以上。CD133+細胞培養(yǎng)8周后，再次通

13、過細胞形態(tài)學(xué)、流式細胞儀、免疫細胞化學(xué)染色和免疫熒光鑒定細胞的干性，CD133CD34雙陽性細胞數(shù)仍為80％以上。
　　 2、CD133+臍血造血祖細胞對不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌細胞中MAP4K4的表達和生物學(xué)特性的影響
　　 (1)MTT體外增殖實驗和平板克隆形成實驗結(jié)果顯示CD133+臍血造血祖細胞可增強不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細胞HCT-116、HT-29和LOVO的體外增殖能力(F=79.457，P=0.000;F=2

14、25.934，P=0.000;F=167.757，P=0.000和t=-9.696，P=0.000;t=-8.890,P=0.000;t=-15.015,P=0.000);
　　 (2)細胞基質(zhì)粘附實驗結(jié)果顯示，CD133+臍血造血祖細胞可增加不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細胞HCT-116、HT-29和LOVO的粘附能力(t=-4.106，P=0.003;t=-5.260,P=0.001;t=-7.924,P=0.000);
　

15、　 (3)由劃痕定性實驗連續(xù)觀察48h的圖片可直觀顯示，CD133+臍血造血祖細胞可增加不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細胞HCT-116、HT-29和LOVO的遷移愈合能力;
　　 (4)Transwell小室遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示，CD133+臍血造血祖細胞可增加不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細胞HCT-116、HT-29和LOVO的遷移和侵襲能力(t=-55.612,P=0.000;t=-40.975,P=0.000;t=-52.012,

16、P=0.000和t=-9.560,P=0.000;t=-7.496,P=0.000;t=-5.878,P=0.000);
　　 (5)熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示，CD133+臍血造血祖細胞可上調(diào)不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細胞HCT-116、HT-29和LOVO中MAP4K4的基因表達水平(t=-13.085,P=0.000;t=-7.060,P=0.000;t=-21.890,P=0.000);
　　 (6)Westernb

17、lot蛋白定性實驗結(jié)果顯示，CD133+臍血造血祖細胞可上調(diào)不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細胞HCT-116、HT-29和LOVO中MAP4K4的蛋白表達水平。
　　 3、利用整體可視化人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移裸鼠模型觀察共移植效應(yīng)
　　 轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細胞SW480/EGFP+穩(wěn)定、高效的表達綠色熒光蛋白，且不影響細胞增殖。采用皮下成瘤和原位移植方法建立結(jié)腸癌可視化轉(zhuǎn)移動物模型。皮下成瘤實驗第23天，SW480/EGFP+單獨注射組裸鼠還

18、有一個部位未成瘤，結(jié)合繪制的皮下瘤生長曲線和統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，CD133+臍血造血祖細胞可增加SW480/EGFP+在免疫缺陷裸鼠的皮下成瘤能力(F=10.388，P=0.006)。原位移植實驗4周后，兩組均可見原位瘤的形成，但均未見有轉(zhuǎn)移情況，8周后，共移植組原位成瘤率為100％，50％發(fā)生肺轉(zhuǎn)臟移，75％發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，100％發(fā)生腸轉(zhuǎn)移。而單獨移植組原位成瘤率為100％，0只裸鼠發(fā)生肺臟和肝臟轉(zhuǎn)移，75％發(fā)生腸轉(zhuǎn)移。通過免疫組織化

19、學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)共移植組原位瘤組織中MAP4K4、MMP-2、MMP-9、Ki-67、SDF-1的表達高于單獨移植組。
　　 結(jié)論
　　 1、牛血清白蛋白(BSA)和SCF、TPO、IL-3、IL-6、Flt3Ligand五種細胞因子按10∶2.5:1:1:1:1的比例組合的培養(yǎng)基培養(yǎng)CD133+臍血造血祖細胞八周后，仍能維持其干性，初步證明，上述培養(yǎng)基是可以長期維持CD133+造血祖細胞干性的有效培養(yǎng)基。
　　 2

20、、CD133+造血祖細胞可顯著促進不同轉(zhuǎn)移潛能人大腸癌細胞的體外增殖、粘附、遷移及侵襲能力，CD133+造血祖細胞與人低轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞裸鼠原位共移植具有促體內(nèi)轉(zhuǎn)移作用，初步證明，造血祖細胞可能對不同轉(zhuǎn)移潛能人大腸癌細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移形成具有重要影響。
　　 3、CD133+造血祖細胞可與不同轉(zhuǎn)移潛能人大腸癌細胞直接作用，能上調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MAP4K4、MMP-2、MMP-9、SDF-1和Ki-67的表達，初步表明:CD13

21、3+造血祖細胞的促不同轉(zhuǎn)移潛能人大腸癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移作用可能與腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MAP4K4、MMP-2、MMP-9、SDF-1和Ki-67的表達有關(guān)。
　　 本研究的創(chuàng)新之處
　　 1、將人造血祖細胞與不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌細胞株共趨化培養(yǎng)，直接在人癌實驗層次揭示了造血祖細胞對不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌細胞的作用。
　　 2、將人造血祖細胞與不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌細胞株共趨化培養(yǎng)后進行人類腫瘤動物模型共移植實