Rho-kinase在心肌缺血-再灌注損傷和缺血預(yù)適應(yīng)中對細胞凋亡的影響及其調(diào)控機制.pdf

1、研究背景：
　　 心肌長時間缺血可以導致組織損傷以及細胞死亡,冠狀動脈再通是緩解缺血損傷的關(guān)鍵,但較長時間缺血后的再灌注卻可導致更為嚴重的損傷,即心臟缺血/再灌注損傷(Ischemia and reperfusion Injury,I/R),I/R的概念于1960年被Jennings等第一次提出。I/R是冠脈再通術(shù)(溶栓、PTCA或搭橋術(shù))后的重要的并發(fā)癥。如何做到既保證盡早恢復(fù)缺血組織的血流灌注,又減輕甚至消除再灌注損傷的發(fā)生

2、便成為缺血性心臟病防治中的重要課題。有效防治再灌注損傷的重要前提是闡明其發(fā)病機制。心肌在遭受一次或多次反復(fù)的短暫缺血再灌注后,會表達出一種對隨后而來的一次長時間的嚴重缺血損傷的抵抗能力的提高,這種現(xiàn)象稱為缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning,IPC),IPC于1986年首次被Murry等發(fā)現(xiàn)。經(jīng)過預(yù)適應(yīng)的心肌能夠縮小心肌梗死的面積,改善心肌收縮力,保護冠狀動脈內(nèi)皮和心肌細胞的超微結(jié)構(gòu),保護微循環(huán),降低再灌注導致的

3、心律失常的發(fā)生率,更快地使心肌從再灌注誘導的心肌頓抑中恢復(fù),是一種內(nèi)源性自我保護方式。
　　 Rho-kinase是一類絲.蘇氨酸蛋白家族,可作為小G蛋白RhoA的直接下游效應(yīng)物,參與多種細胞生物功能,如:平滑肌收縮、肌動蛋白細胞骨架組裝、細胞黏附、移動、基因表達等。Rho-kinase以兩種同源性極高的異構(gòu)體形式存在:ROCK-1(或ROKβ、p160ROCK)和ROCK-2(或ROKα)。ROCK-1位于18號染色體,含有1

4、354個氨基酸,ROCK-2位于12號染色體,含有1388個氨基酸。二者有65％的同源性,而在激酶結(jié)構(gòu)域則有92％的同源性。Y-27632和fasudil是ROCK的選擇性抑制劑,作用于其ATP依賴激酶區(qū),可同時抑制ROCK-1和ROCK-2。Rho-kinase可以介導下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng),已有20多種下游蛋白被發(fā)現(xiàn)。如:MLC、MYPT-1、ERM、PTEN、IRS1、NHE1、LIM激酶等。最具特征意義的Rho-kina

5、se底物是MLC(myosin light chain)和MYPT-1(myosin binding subunit of MLCphosphorylation,MLC磷酸酶的肌球蛋白結(jié)合亞基)。Rho-kinase可以通過作用于MLC或MYPT1來增加胞漿內(nèi)MLC的磷酸化,促進肌動蛋白微絲骨架的聚合。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn),Rho-kinase參與了變異性心絞痛、心衰、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病。初步研究表明Rho-kina

6、se在心臟I/R損傷中活性增加,而在IPC中活性可能降低,但是其中發(fā)生機制卻遠未清楚。例如Rho-kinase調(diào)控哪些細胞因子,通過哪些信號途徑發(fā)揮作用,以及在IPC中Rho-kinase活性是否會降低,Rho-kinase活性降低的機制如何,這些問題構(gòu)成了本研究課題的內(nèi)容。在本研究中,我們擬建立大鼠I/R和IPC模型,明確Rho-kinase活性在IPC和I/R中是否不同,Rho-kinase對心肌梗死面積、心肌細胞凋亡的影響以及對細

7、胞凋亡有關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)；明確IPC中ERK-MAPK是否能通過下調(diào)Rho-kinase活性起到抗心肌細胞凋亡作用。通過以上研究,進一步明確Rho-kinase在心臟I/R.和IPC中所起的作用及其機制。這對于闡明I/R和IPC的發(fā)病機制,為心肌保護提供新的治療途徑具有重要的意義。
　　 本研究共分三部分進行:
　　 第一部分 Rho-kinase在心臟缺血再灌注損傷和心肌缺血預(yù)適應(yīng)中的表達及其對細胞凋亡的影響；

8、　　 第二部分心臟缺血再灌注損傷中Rho-kinase對AIF的影響及調(diào)節(jié)機制；
　　 第三部分心肌缺血預(yù)適應(yīng)中ERK對Rho-kinase的調(diào)節(jié)。
　　 第一部分 Rho-kinase在心臟缺血再灌注損傷和心肌缺血預(yù)適應(yīng)中的表達及其對細胞凋亡的影響
　　 研究目的：
　　 本部分研究擬建立大鼠I/R和IPC模型,應(yīng)用藥物fasudil抑制Rho-kinase活性,測定心肌梗死面積、心肌細胞的凋亡,明確

9、Rho-kinase在心臟I/R和IPC中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.大鼠心臟I/R和IPC模型的建立和分組:采用開胸結(jié)扎和松開冠狀動脈的方法建立大鼠心臟I/R和IPC型。分為以下四組:對照組(18只)、I/R組(18只)、I/R+fasudil組(18只)和IPC組(18只)。
　　 2.Rho-kinase活性的檢測:Rho-kinase的活性通過Western檢測其特異性底物MYPT-1的磷酸化水

10、平來表示。
　　 3.心肌梗死面積檢測:采用伊文思藍染色鑒別非缺血區(qū)與缺血危險區(qū)(AAR),硝基四氮唑藍(NBT)染色鑒別梗死心肌與非梗死心肌。以稱重法計算心肌缺血危險區(qū)(伊文思藍未染區(qū)),梗死區(qū)(NBT未染區(qū))的重量,心肌梗死范圍的大小以梗死區(qū)重量占缺血危險區(qū)重量的百分比表示。
　　 公式為:心肌梗死范圍=NBT未染區(qū)/伊文思藍未染區(qū)×100％
　　 4.大鼠心肌細胞凋亡的檢測:采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的末

11、端標記技術(shù)(TUNEL)試劑盒檢測各組大鼠心肌細胞的凋亡。按照試劑盒說明書操作。標記前用DNA酶處理切片做陽性對照,用標記液代替TdT酶反應(yīng)液做陰性對照。每張切片隨機選取10個視野(×400倍),計數(shù)凋亡細胞個數(shù)和所有細胞個數(shù),以凋亡細胞個數(shù)/所有細胞個數(shù)反映各組心肌細胞凋亡的情況。
　　 5.Caspase-3活性的檢測:Caspase-3的活性通過Western檢測其裂解產(chǎn)物cleaved-Caspase-3的表達水平來表示

12、。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.p-MYPT-1(磷酸化的MYPT-1)在I/R中大量表達,而在IPC中活性降低。在I/R中應(yīng)用Rho-kinase抑制劑fasudil后,p-MYPT-1表達降低:對照組中只有微弱的p-MYPT-1表達。說明Rho-kinase在I/R中活性增加,而IPC和fasudil均抑制了Rho-kinase的活性。
　　 2.Rho-kinase活性的抑制可減少大鼠心肌梗死面積:I/R組

13、大鼠的心肌梗死面積占危險區(qū)心肌面積的60.3±4.08％,I/R+fasudil組大鼠的心肌梗死面積/AAR減少至38.62±2.66％,說明在I/R大鼠中抑制Rho-kinase活性后能顯著減少心肌梗死面積。在IPC中大鼠的心肌梗死面積降至29.16±1.08％,說明IPC可能通過降低Rho-kinase活性而明顯縮小心肌梗死面積。
　　 3.Rho-kinase活性的抑制可減少大鼠心肌細胞凋亡率:在對照組大鼠心肌中無TUNE

14、L染色陽性細胞。在I/R組大鼠心肌中,TUNEL染色陽性細胞占全部細胞的33.87±1.57％,說明I/R可引起心肌細胞凋亡增加。在I/R+fasudil組大鼠心肌中,TUNEL染色陽性細胞占全部細胞的17.05±4.22％,說明在I/R大鼠中抑制Rho-kinase活性能減少心肌細胞凋亡率。在IPC中,細胞凋亡率為17.29±0.84％,說明IPC可能通過降低Rho-kinase活性而明顯降低心肌細胞凋亡率。
　　 4.Rho

15、-kinase活性的抑制降低Caspase-3活性:在I/R中cleaved-Caspase-3大量表達,在IPC和I/R+fasudil組中其表達分別減少了約65.3％和58.5％,說明IPC和fasudil在抑制Rho-kinase活性同時抑制了Caspase-3的活性。
　　 結(jié)論：
　　 1.在大鼠心肌I/R損傷中Rho-kinase活性明顯增加,加重了心臟的損傷、增加了心肌細胞凋亡。
　　 2.在大鼠心

16、肌I/R損傷中抑制Rho-kinase活性后能減少心肌梗死面積和心肌細胞的凋亡率,減輕心肌細胞的損傷程度。
　　 3.IPC中Rho-kinase活性降低,心肌梗死面積和心肌細胞凋亡減輕,具有心臟保護作用。
　　 第二部分心臟缺血再灌注損傷中Rho-kinase對AIF的影響及調(diào)節(jié)機制
　　 研究目的：
　　 探討在大鼠心臟I/R中Rho-kinase對AIF的影響及調(diào)節(jié)機制。(Rho-kinase/JN

17、K/AIF信號通路在心臟I/R損傷中的作用)
　　 研究方法：
　　 1.大鼠心臟I/R損傷模型的建立,分為以下5組:對照組(18只)、I/R+NS組(18只)、I/R+fasudil組(18只)、I/R+SP600125(JNK抑制劑)組(18只)和I/R+DMSO組(18只)。
　　 2.心肌梗死面積檢測,計算梗死心肌面積占危險區(qū)(AAR)心肌面積百分比。
　　 3.TUNEL法檢測細胞凋亡。