腦內注射IL-1Ra對利血平誘導的大鼠行為性抑郁和海馬神經(jīng)再生的影響.pdf

1、背景與目的:
　　近年來抑郁障礙已成為臨床上最常見的一個問題。目前對抑郁癥的神經(jīng)生化研究主要有單胺類神經(jīng)遞質假說,神經(jīng)內分泌功能失調及神經(jīng)可塑性研究等。根據(jù)神經(jīng)可塑性的研究,有人提出神經(jīng)源性假說,認為海馬新生神經(jīng)元的產(chǎn)生減少導致抑郁癥的發(fā)病機制?？挂钟羲幹委熀罂砂l(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)再生的增加,抗抑郁藥可以促進海馬神經(jīng)再生。大量的臨床前研究證實應激可以抑制海馬神經(jīng)再生。應激性生活事件是引起抑郁癥的重要原因。應激誘導的神經(jīng)發(fā)生減少可能是引起抑

2、郁癥的一種重要的影響因子?？挂钟羲幹委熆梢宰钄鄳ひ鸬暮ｑR神經(jīng)再生的減少。5-HT神經(jīng)遞質及5-HT類抗抑郁藥可以增加海馬齒狀回神經(jīng)再生,同時也可以治療抑郁癥。而且,臨床抗抑郁藥物多數(shù)使用1月左右才能夠起效,這與海馬齒狀回神經(jīng)再生從增殖到分化成熟過程經(jīng)歷的時間相平衡。這可能成熟海馬神經(jīng)再生可能是抗抑郁藥療效的載體,而因此研究海馬神經(jīng)再生對于揭示抑郁癥發(fā)病的生物學機制具有重要意義。
　　腦內IL-1β是介導抑郁癥的重要物質。IL-

3、1β是腦內神經(jīng)-內分泌-免疫系統(tǒng)中關鍵的炎性細胞因子,在腦內發(fā)揮重要的生理調節(jié)功能。目前大量臨床和動物實驗結果提示腦內炎性細胞因子參與抑郁癥的發(fā)病過程。腦內IL-1β可引起人和動物的“病態(tài)行為”,抗抑郁藥物治療行為性抑郁大鼠,既可減輕抑郁癥的癥狀,又可降低大鼠腦內IL-1β的水平。動物實驗,腦室內注射IL-1β可誘導大鼠的行為性抑郁,并且IL-1β受體拮抗劑可部分阻斷利血平誘導的大鼠的行為性抑郁。腦內注射IL-1β可降低海馬神經(jīng)再生,I

4、L-1β可能介導了海馬的神經(jīng)再生過程,進一步影響到了抑郁癥的發(fā)展。
　　本研究擬在利血平誘導的大鼠行為性抑郁模型中探討腦內IL-1β影響神經(jīng)元再生過程在抑郁癥發(fā)病中的作用。探討炎性細胞因子、神經(jīng)再生與抑郁癥的關系,分析可能的神經(jīng)生物學機制,為抑郁癥的治療提供新的靶點。
　　材料與方法:
　　行為性抑郁動物模型與檢測:
　　健康、性成熟清潔級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,體重200～260g,飼養(yǎng)在

5、26℃、12:12小時光照-黑暗循環(huán)的動物房中,自由飲食和飲水。本實驗采用4mg/kg的利血平劑量腹腔注射,對照組注射相應的利血平溶劑,建立利血平行為性抑郁模型,通過強迫游泳試驗檢測大鼠抑郁樣行為。
　　實驗分組:
　　腹腔注射利血平對大鼠海馬神經(jīng)再生影響實驗隨機分為對照組(Controlgroup,C)和利血平組(Reserpinegroup,R)。在IL-1Ra對大鼠海馬神經(jīng)前體細胞增殖影響的實驗中,隨機分為對照組(Co

6、ntrolgroup,C)和利血平組(Reserpinegroup,R),其中每組的一半大鼠腦內注射IL-1Ra或PBS。具體分組為:對照組(Controlgroup,C),利血平組(Reserpinegroup,R),對照+L-1Ra組(C+L-1Ra),利血平+IL-1Ra組(R+IL-1Ra)。
　　側腦室插管與注射:
　　在對側腦室插管注射IL-1Ra對大鼠海馬神經(jīng)前體細胞增殖影響的實驗研究中實驗大鼠先進行側腦室導管

7、安裝實驗。通過單臂大鼠腦立體定位儀,定位大鼠右側側腦室(前囟后0.9mm,旁1.5mm,顱骨下深3.8mm),插入大鼠腦室微量注射系統(tǒng)套管。固定放置1周后進行藥物注射。其中0.01MPBS和0.25ug/ulIL-1Ra通過微量注射泵經(jīng)側腦室插管注射,4mg/kg利血平和相應劑量的乙酸隨后進行腹腔注射。
　　海馬神經(jīng)再生的檢測:
　　在利血平注射40h后各組均開始腹腔注射Brdu,75mg/kg,4次/2h,標記海馬神經(jīng)再生

8、過程。藥物注射后均以生理鹽水和4％多聚甲醛灌注后,制作冰凍切片,檢測大鼠海馬神經(jīng)再生過程包括神經(jīng)前體細胞的增殖、分化和新生神經(jīng)元改變等。側腦室插管大鼠需要制作大鼠側腦室插管部位切片,檢驗插管定位的準確性。利血平注射后48h的大鼠組織用于檢測海馬齒狀回神經(jīng)前體細胞增殖;利血平注射后72h的大鼠組織用于檢測海馬齒狀回神經(jīng)前體細胞分化及新生未成熟神經(jīng)元;利血平注射后4周的大鼠組織用于檢測海馬齒狀回新生成熟神經(jīng)元的存活。
　　數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)

9、計:
　　采用Image-ProPlus6.0(IPP)軟件分析免疫組化圖片。實驗數(shù)據(jù)應用Excel2003和SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,統(tǒng)計結果以均數(shù)±標準差(x±SD)表示,數(shù)據(jù)間采用獨立樣本t檢驗或方差分析。以P≤0.05為差異具有顯著性,P≤0.01為差異具有高度顯著性。
　　結果:
　　第一部分:利血平誘導的行為性抑郁和海馬神經(jīng)再生改變
　　1、腹腔注射利血平誘導大鼠行為性抑郁
　　利血

10、平組腹腔注射利血平4mg/kg,對照組腹腔注射2%乙酸溶劑,0、24、48和72小時進行15分鐘游泳試驗,測定大鼠的漂浮時間,作為行為性抑郁的指標。結果表明,對照組與利血平組大鼠游泳試驗24h(7.0±0.5和13.4±0.9),48h(7.2±0.6和12.9±0.7),72h(8.0±0.8和12.6±0.9)漂浮時間相比差異具有顯著性(ANONA,P<0.01)。與對照組相比利血平組大鼠在利血平腹腔注射后的24～72小時,大鼠的漂

11、浮時間顯著延長,作用高峰在24～48小時。結果表明,腹腔注射4mg/kg的利血平后24-72小時的大鼠具有行為性抑郁樣表現(xiàn)。
　　2、利血平誘導的行為性抑郁大鼠海馬神經(jīng)再生的改變
　　目前發(fā)現(xiàn)終生可以神經(jīng)再生的部位:嗅覺系統(tǒng)的SVZ區(qū)和海馬結構齒狀回SGZ區(qū)。成熟腦海馬齒狀回的SGZ區(qū)存在多功能的前體細胞。前體細胞可以增殖、遷移分化、成熟生產(chǎn)新生的神經(jīng)元、星型膠質細胞或少突膠質細胞等,整個過程成為神經(jīng)再生。大鼠海馬齒狀回神經(jīng)

12、再生周期約為4周,其中神經(jīng)前體細胞被Brdu標記后增殖持續(xù)12-14h。在增殖后的2h開始逐漸向海馬齒狀回顆粒細胞層遷移。增殖后的神經(jīng)前體細胞在第2-7天內進行分化,其中分化的新生神經(jīng)元在1月左右成熟,表達成熟神經(jīng)元的標記物NeuN等。
　　利血平組(Reserpinegroup,R)腹腔注射利血平(4mg/kg),對照組(Controlgroup,C)注射相應劑量的乙酸溶劑。大鼠腹腔注射利血平后40小時,兩組開始腹腔注射Brdu

13、(75mg/kg),每2小時1次,注射4次。對應海馬神經(jīng)再生的時間過程,分別在注射利血平48h、72h和4周心臟灌注取腦,分別檢測腦內海馬齒狀回神經(jīng)前體細胞增殖、分化和新生神經(jīng)元改變情況。
　　2.1.利血平誘導的行為性抑郁大鼠海馬神經(jīng)前體細胞增殖的改變
　　用Brdu標記大鼠海馬神經(jīng)再生過程,同時通過內源性增殖標記物Ki67檢測海馬神經(jīng)前體細胞增殖。觀察腹腔注射利血平對海馬神經(jīng)前體細胞增殖的影響。Brdu和Ki67陽性細胞

14、在腦部結構中主要集中在海馬齒狀回SGZ區(qū)。其中單位齒狀回面積的Brdu陽性細胞在對照組和利血平組的數(shù)目分別為10.86±1.40、5.18±1.16。單位齒狀回面積的Ki67陽性細胞在對照組和利血平組的數(shù)目分別為22.4±9.88、11.38±6.71。與對照組相比,利血平組單位海馬齒狀回面積的Brdu陽性細胞數(shù)(t=2.162,P<0.01)和Ki67陽性細胞數(shù)(t=2.695,P<0.05)明顯減少,差異具有顯著性。結果顯示,利血平

15、誘導的行為性抑郁大鼠的海馬神經(jīng)前體細胞增殖受到抑制。
　　2.2.利血平誘導的行為性抑郁大鼠海馬神經(jīng)前體細胞分化的改變
　　腹腔注射利血平后48h心臟灌注,組織冰凍切片用Brdu免疫組織化學方法檢測腦內海馬齒狀回SGZ區(qū)神經(jīng)前體細胞分化。Brdu陽性細胞主要集中在海馬齒狀回SGZ區(qū)。兩組大鼠單位海馬齒狀回面積的Brdu陽性細胞數(shù)經(jīng)Lg10數(shù)據(jù)轉換后,進行K-S檢驗后符合正態(tài)分布。兩組單位海馬齒狀回Brdu陽性細胞數(shù)量分別為3

16、.70±3,71和0.42±0.73。與對照組相比,利血平組大鼠海馬齒狀回SGZ區(qū)單位海馬齒狀回面積的Brdu陽性細胞數(shù)量明顯減少,差異具有顯著性(P<0.05)。結果表明利血平行為性抑郁大鼠的海馬神經(jīng)前體細胞分化過程受到抑制。
　　2.3.利血平誘導的行為性抑郁大鼠海馬新生神經(jīng)元的改變
　　在海馬神經(jīng)再生過程第2-10天,神經(jīng)前體細胞逐漸向神經(jīng)元分化,開始表達doublecortin(DCX),可作為新生未成熟神經(jīng)元標記物

17、。在7-10天開始表達成熟神經(jīng)元具有的NeuN等,1月后70%新生神經(jīng)元表達成熟神經(jīng)元標記物。
　　2.3.1.利血平誘導的行為性抑郁大鼠海馬新生未成熟神經(jīng)元的改變
　　利血平腹腔注射后72h心臟灌注兩組大鼠,用免疫組織化學方法檢測腦內海馬齒狀回DCX(雙皮質激素)的表達,DCX表達于新生未成熟神經(jīng)元,用于檢測新生未成熟神經(jīng)元。與對照組相比,利血平組大鼠海馬齒狀回DCX陽性細胞數(shù)量、樹突長度和樹突數(shù)量差異均無顯著性。結果表明

18、利血平在72h的短期內對海馬齒狀回新生未成熟神經(jīng)元沒有直接影響。
　　2.3.2.利血平誘導的行為性抑郁大鼠海馬新生成熟神經(jīng)元存活的改變
　　腹腔注射利血平后4周兩組大鼠,心臟灌注后制作冰凍切片,Brdu免疫組織化學及Brdu和NeuN免疫熒光雙標法檢測海馬齒狀回新生神經(jīng)元的存活。兩組大鼠單位海馬齒狀回面積的Brdu和NeuN雙標細胞數(shù)經(jīng)Lg10數(shù)據(jù)轉換后,進行K-S檢驗后符合正態(tài)分布。對照組和利血平組Brdu和NeuN雙標

19、細胞數(shù)分別為3.80±2.83和0.82±0.99。與對照組相比,利血平組大鼠單位海馬齒狀回面積的Brdu和NeuN雙標細胞數(shù)明顯減少,差異具有顯著性(P<0.05)。結果表明利血平行為性抑郁大鼠的海馬新生神經(jīng)元的存活受到抑制。
　　第二部分:腦內IL-1β對利血平誘導的行為性抑郁和海馬再生的影響
　　1、腹腔注射利血平誘導大鼠行為性抑郁
　　利血平組大鼠腦室注射IL-1Ra,對照組大鼠腦室注射等體積0.01MPBS,

20、同時腹腔注射利血平(4mg/kg)或相應劑量的乙酸溶劑后,分別在注射后的1、24和48h測定游泳試驗。結果顯示,在利血平注射后的1h和24h,腦室注射IL-1Ra對利血平引起的漂浮時間的延長沒有影響;在利血平注射后48h,R與R+IL-1Ra兩組間的平均漂浮時間為12.87±0.78和8.68±0.76。腦室注射IL-1Ra可反轉利血平引起的漂浮時間的延長(ANOVA,P<0.01;組間差異比較用SNK法);單純腦室注射IL-1Ra對正

21、常大鼠的游泳試驗沒有影響。
　　2、腦內注射IL-1Ra對利血平誘導的行為性抑郁大鼠海馬神經(jīng)前體細胞增殖的影響
　　免疫組織化學方法檢測腦內海馬齒狀回SGZ區(qū)神經(jīng)前體細胞增殖。在大鼠海馬結構中,Brdu陽性細胞主要集中在齒狀回SGZ區(qū)。C、R、C+IL-1Ra和R+IL-1Ra4組大鼠單位海馬齒狀回面積的Brdu陽性細胞數(shù)分別為5.07±5.66、3.30±2.31、0.97±0.86、6.06±5.13,經(jīng)平方根數(shù)據(jù)轉換后

22、,進行K-S檢驗后符合正態(tài)分布。結果顯示,正常大鼠腦室注射IL-1Ra對單位海馬齒狀回面積的Brdu陽性細胞數(shù)量沒有影響(P>0.05,CvsC+IL-1Ra）。結果提示，腦室利血平可導致大鼠
　　的海馬神經(jīng)前體細胞增殖受到抑制，而腦內注射 IL-1Ra 可以逆轉利血平誘導的海馬神經(jīng)前
　　體增殖的抑制。
　　結論:
　　腹腔注射利血平可以誘導大鼠行為性抑郁，同時海馬神經(jīng)再生過程受到抑制，而IL-1受體拮抗劑可以