DMOG改善骨髓間充質干細胞生存能力以及相關機制的探討.pdf

1、實驗背景： 隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展和人民生活水平的提高，心腦血管疾病已經(jīng)成為人類健康的頭號殺手。心肌梗死的發(fā)生率、致殘率和致死率明顯上升，盡管近年來藥物治療和介入治療得到了快速發(fā)展，缺血性心肌病患者的預后有了明顯的改善，但藥物治療和介入治療終歸不能修復壞死的心肌。骨髓間充質干細胞(MSCs)具有自我更新能力和橫向分化能力，移植到心梗局部后能夠分化為內皮細胞、血管平滑肌細胞和心肌細胞樣細胞，促進新生血管的形成。大量的基礎研究和臨床前期

2、研究發(fā)現(xiàn)MSCs能夠挽救瀕死的心肌，減少心梗面積進而改善心肌梗死后的心功能，因此骨髓間充質干細胞在心血管疾病中的應用是近年來研究的熱點，成為攻克心血管疾病難題的一種非常有前景的治療手段。但是，MSCs改善心功能的能力有限，大量的證據(jù)表明MSC移植對心功能的改善是輕中度的，大部分研究結果顯示MSCs移植對心功能的改善只有5-6％左右，甚至有些臨床試驗沒有觀察到心功能的改善，這遠遠達不到我們的預期，其中一個很重要的原因是絕大多數(shù)的細胞移植到

3、體內后在很短的時間內發(fā)生死亡，研究報道90％的MSCs在移植后的1天內死亡。因此，找到一種能夠提高MSCs生存能力的方法顯得尤為迫切。 DMOG是一種脯氨酰羥化酶抑制劑，能夠抑制細胞內HIF-1α的降解，繼而使細胞核內很多基因(如EPO、VEGF、Ang1和Glut-1等)的轉錄和表達增高，繼而發(fā)揮其保護性作用。在缺血再灌注心肌損傷和急性心肌梗死的動物模型中發(fā)現(xiàn)，DMOG能夠發(fā)揮降低大鼠的心肌重構和抑制炎癥反應等保護作用。在體外

4、的研究中發(fā)現(xiàn)，DMOG能夠改善腫瘤細胞和神經(jīng)元在缺血清或缺神經(jīng)營養(yǎng)因子等惡劣環(huán)境下的生存能力。但是，DMOG到底能否改善MSCs的生存能力目前沒有報道。 實驗目的： 研究DMOG是否能增強骨髓間充質干細胞(MSCs)的生存能力，并對可能的作用機制進行探討。 實驗方法： 建立經(jīng)典的缺血清的凋亡模型，分為正常對照組(Control)、缺血清組(SD)和缺血清DMOG干預組(SD+DMOG)三大組，其中SD+D

5、MOG組又分為100μM、500μM和1000μM三個小組。應用western-blot技術檢測DMOG能否降低HIF-1α的在細胞內的降解以及上調其下游Glut-1的表達情況；應用臺盼藍方法來評估DMOG對正常有血清條件培養(yǎng)下的MSCs的毒性作用；通過相差顯微鏡觀察不同組中MSCs形態(tài)學上的改變，經(jīng)缺血清處理后的凋亡細胞體積縮?。粦肏oechst染MSCs的細胞核，通過熒光顯徼鏡觀察不同組中MSCs細胞核的改變，凋亡細胞染色質濃聚、

6、細胞核縮小甚至斷裂，熒光顯微鏡下表現(xiàn)為核小雨亮和不完整；應用免疫組化對cleavedcaspase-3進行染色，陽性細胞定義為凋亡細胞，并使用Hoechst進行染核計算細胞總數(shù)，陽性細胞除以總細胞數(shù)即為凋亡率；western-blot檢測cleavedcaspase-3的表達情況，以進一步驗證免疫組化染色的準確性，并進一步探討DMOG對MSCs凋亡保護的時程進行分析，分6h、12h和24h三個時間點；應用臺盼藍方法對MSCs進行染色來檢

7、測細胞死亡情況，陽性細胞即為死亡細胞，陽性細胞除以總細胞數(shù)即為死亡率。通過比較不同組之間凋亡和死亡指標的變化，說明DMOG對缺血清條件下MSCs的保護作用。對于除HIF-1α通路外其他的可能作用機制，我們檢測了經(jīng)典的影響細胞凋亡的線粒體通路和與細胞生存密切相關的PI3K/Akt通路。應用western-blot技術檢測細胞色素C蛋白在線粒體、胞漿中的表達情況，分析在缺血清狀況下細胞色素C從線粒體釋放到胞漿中(細胞色素C將進一步與Apaf

8、-1和pro-caspase9形成凋亡復合體激活凋亡通路)的情況，探討線粒體途徑中caspase-3依賴性的凋亡通路在DMOG抗凋亡中的作用；應用western-blot技術檢測凋亡誘導因子(AIF)在胞漿和核蛋白中的表達情況，分析在缺血清狀況下AIF從胞漿轉錄到細胞核(AIF轉錄到細胞核后也能夠啟動細胞凋亡程序)的情況，探討線粒體途徑中非caspase-3依賴性的凋亡通路在DMOG抗凋亡中的作用，應用western-blot技術檢測A

9、kt和磷酸化Akt、ERK和磷酸化ERK的表達情況，明確DMOG能否激活PI3K/Akt和/或MEK/ERK通路，然后應用PI3K特異性阻斷劑wortmannin阻斷PI3K/Akt通路后，觀察DMOG的保護作用(重新檢測cleavedcaspase-3染色和臺盼藍分別評估細胞凋亡和死亡)是否消失，從反面來證明DMOG的保護作用是否通過該通路。 實驗結果： DMOG在作用濃度范圍內，對MSCs沒有明顯的毒性作用，卻能夠劑

10、量依賴性地降低MSCs內HIF-1α的降解，上調其下游Glut-1的表達。DMOG能夠呈劑量依賴性地改善缺血清后MSCs的形態(tài)學上的細胞縮小情況，使Hoechst陽性的細胞核數(shù)量明顯降低，cleavedcaspase-3的表達降低。Western-blot結果進一步確認了免疫染色cleavedcaspase-3的結果，并提示從缺血清6h開始，DMOG就有降低凋亡的趨勢，到12h和24h時達到了統(tǒng)計學差異.類似地，根據(jù)臺盼藍染色結果DMO

11、G能夠呈劑量依賴性地降低MSCs經(jīng)缺血清處理后的細胞死亡，從12h開始到72h均能不同程度地降低細胞死亡，具有顯著的統(tǒng)計學意義，以上說明DMOG能夠降低缺血清所引起的MSCs凋亡和死亡，并呈劑量依賴性和有一定的作用時程。缺血清能夠使細胞色素C從線粒體釋放到胞漿的數(shù)量增加，而DMOG卻能降低這種過程；類似地，DMOG能夠降低缺血清所引起的AIF的從胞漿向細胞核的轉位，說明DMOG能夠降低caspase依賴的和非依賴的凋亡通路而發(fā)揮保護作用

12、。缺血清能夠明顯降低MSCs的Akt和ERK的磷酸化水平，DMOG能夠逆轉Akt的磷酸化表達水平而不能逆轉ERK的活化，提示PI3K/Akt通路而不是MEK/ERK通路可能在DMOG的保護中發(fā)揮一定的作用.應用PI3K/Akt通路的特異性阻斷劑wortamannin后，發(fā)現(xiàn)DMOG逆轉的Akt磷酸化水平作用消失，相應地，DMOG對MSCs凋亡和死亡的保護作用(分別由cleavedcapase-3和臺盼藍染色檢測)也消失了，這從反面也證實

13、了PI3K/Akt通路在DMOG保護中的作用。 實驗結論： 1、DMOG能夠降低MSCs內HIF-1α的降解和上調下游Glut-1的表達，在作用濃度下對MSCs沒有明顯的毒性作用； 2、DMOG能夠降低缺血清狀況下MSCs的凋亡和死亡； 3、caspase-3依賴的和非依賴的線粒體通路可能在DMOG對MSCs保護中發(fā)揮了一定的作用； 4、PI3K/Akt通路在DMOG對MSCs的保護中發(fā)揮了重要的