高靈敏SERS基底的制備及其在芽孢桿菌檢測中的應(yīng)用.pdf

1、發(fā)展靈敏的、選擇性的快速檢測細(xì)菌芽孢的方法對于醫(yī)療診斷和人類健康治療來說顯得越來越重要。近年來，表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)技術(shù)因其具有的高靈敏度、高分辨率以及快速響應(yīng)而在生物分子檢測應(yīng)用中吸引了眾多研究工作者的興趣。構(gòu)建SERS基底的一個關(guān)鍵性的挑戰(zhàn)是基底不僅需具備生物兼容性，而且還要能有力地實現(xiàn)理想的檢測靈敏度和選擇性。在本文中，設(shè)計了一種新型的基于金納米粒子的SERS基底，并證明了其對細(xì)菌芽孢中釋放出來的生物標(biāo)志物的檢測可以獲得高

2、靈敏度和低檢測限。將在以下幾個密切相關(guān)的領(lǐng)域中討論主要的研究發(fā)現(xiàn)。
　　金納米粒子/聚乙烯吡咯烷酮/金基底(AuNPs/PVP/Au)的制備及其SERS效應(yīng)將被首次討論(第2章)。關(guān)于Au NPs的粒徑與SERS基底的增強(qiáng)效應(yīng)兩者間相互關(guān)系的研究工作表明：60 nm金粒子制備的基底獲得的SERS增強(qiáng)效應(yīng)最大，增強(qiáng)因子可達(dá)～106。這一類型基底具備的強(qiáng)SERS效應(yīng)來源于Au NPs-Au NPs及AuNPs-金基底間的相互作用所產(chǎn)生

3、的雙重耦合效應(yīng)，還通過控制納米粒子的尺寸范圍(50-70 nm)對其進(jìn)行了優(yōu)化。
　　該AuNPs/PVP/Au基底經(jīng)實驗證明可以實現(xiàn)高靈敏檢測吡啶2，6-二羧酸(簡稱DPA，為細(xì)菌芽孢中的生物標(biāo)志物)(第3章)。在考察DPA濃度與SERS特征峰之強(qiáng)度兩者關(guān)系的工作中觀察到了兩個線性范圍，“低濃度區(qū)域”(<0.01 ppm)及“高濃度區(qū)域”(>1 ppm)，并且在這二者之間還存在著一個“過渡區(qū)域”。在SERS檢測DPA的研究中，能

4、在這樣一個低濃度區(qū)觀察到線性關(guān)系實屬首例。實驗結(jié)果證明利用60 nm的AuNPs制備的基底可以獲得0.1 ppb的檢測限，據(jù)所知該極限值為在此類SERS基底檢測DPA的報道中最低值，低濃度的DPA在AuNPs/PVP/Au基底上獲得的極大K值(1.7×107 M-1)也可以證明這一發(fā)現(xiàn)。為了洞察DPA濃度與SERS強(qiáng)度間的相關(guān)性，依據(jù)“單分子層和多分子層吸附等溫線”對DPA在SERS基底上的吸附特征進(jìn)行了分析。認(rèn)為實驗中所觀察到的介于低

5、和高濃度區(qū)域之間的“過渡”對應(yīng)于吸附等溫線從單分子層吸附到多分子層吸附的“轉(zhuǎn)變”，而且該“過渡區(qū)域”的實驗數(shù)據(jù)與我們估算出來的滿一個單分子層覆蓋所需DPA的最低濃度理論值(～0.01 ppm)十分吻合。
　　為了確定這一新型SERS基底的光譜鑒別和定量能力，也為了解生物標(biāo)志物DPA在納米粒子修飾的基底上是否可能發(fā)生表面反應(yīng)，認(rèn)為有必要考察生物標(biāo)志物和其脫羧反應(yīng)的可能性產(chǎn)物一吡啶(Py)的競爭吸附體系(第4章)。在實驗數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)

6、：DPA和Py兩者雖然在它們的環(huán)呼吸振動模式相關(guān)的SERS光譜范圍內(nèi)(900-1100 cm-1)顯示出一些相似性，但是二者在AuNPs/PVP/Au基底上的獨立吸附和競爭吸附的特征波譜中都表現(xiàn)出了明顯差別。在實驗檢測的濃度范圍內(nèi)，Py在基底上獲得的吸附平衡常數(shù)(～8×105)比DPA的(～1×105)大得多，原因是Py在Au表面上的綁定能力比DPA的強(qiáng)。實驗結(jié)果不但提供了本SERS檢測條件下生物標(biāo)志物在基于金納米粒子的基底上物種形成的

7、準(zhǔn)確信息，而且也驗證了此類基底在有表面反應(yīng)存在或無表面反應(yīng)存在的條件下實現(xiàn)高靈敏、高選擇性檢測細(xì)菌標(biāo)志物的可行性。
　　通過分析pH和陰離子對樣品溶液SERS強(qiáng)度的影響從而系統(tǒng)地研究了影響SERS檢測AuNPs/PVP/Au基底上DPA的因素(第5章)。實驗結(jié)果表明：SERS的強(qiáng)度會隨著pH值的下降而上升，認(rèn)為此現(xiàn)象反映了DPA在SERS基底上存在著吸附模式的“質(zhì)子化-脫質(zhì)子化”間的平衡。溶液中存在的不同陰離子也對SERS強(qiáng)度有著

8、一定的影響，反映了不同陰離子在SERS基底上綁定能力的差異。
　　將上述SERS基底作為光譜探針檢測枯草芽孢桿菌的芽孢，以達(dá)到進(jìn)一步檢驗該基底性能的目的，實驗結(jié)果證明：其對細(xì)菌芽孢中釋放出來的標(biāo)志物鈣化DPA(CaDPA)也具有高靈敏性(第6章)。利用硝酸從芽孢中萃取出的CaDPA在SERS檢測中獲得了一系列特征光譜，并且得到了1.5×109 spores/L(即：2.5×10-14M)的檢測限(LOD)。將Au納米粒子構(gòu)建的SE

9、RS基底和報道中的Ag納米粒子基底相比較不難發(fā)現(xiàn)：二者獲得的LOD值非常接近，但是前者的表面吸附平衡常數(shù)比后者的小了1～2個數(shù)量級。上述這一系列的發(fā)現(xiàn)均證明了Au納米粒子制備的SERS基底是可以直接作為高分辨率、高靈敏的生物兼容性探針而應(yīng)用于細(xì)菌芽孢的檢測。
　　此外，為了建立在不同條件下對細(xì)菌芽孢的SERS檢測，又考察了芽孢的儲備時間和檢測環(huán)境對SERS檢測的影響(第7章)。實驗中以AuNPs/PVP/Au基底為探針檢測到了芽孢

10、在特定條件下“自釋放”出的CaDPA，這一發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報道中關(guān)于芽孢在控制溫度和濕度的條件下可以追蹤到CaDPA的釋放是一致的。在關(guān)于激光功率對SERS強(qiáng)度的影響這一研究中發(fā)現(xiàn)：后者隨著前者的增大而上升。這一發(fā)現(xiàn)證明：相比其他物種在不同激光功率下表現(xiàn)的不穩(wěn)定性，從芽孢中釋放出來的DPA/CaDPA在本實驗條件的激光照射下是穩(wěn)定的。
　　綜上所述，本工作中構(gòu)建的AuNPs/PVP/Au基底可以被確認(rèn)為是檢測枯草芽孢桿菌中生物標(biāo)志物的高