NF-κB在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制及激素抵抗中的意義研究.pdf

1、目的： 潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,UC)又稱(chēng)非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種病因不明的直腸和結(jié)腸炎性疾病。病變主要累及大腸粘膜與粘膜下層。臨床表現(xiàn)為腹瀉、粘液膿血便、腹痛。病情輕重不等，多呈反復(fù)發(fā)作慢性病程。 對(duì)于UC病因和發(fā)病機(jī)制的研究，目前尚未明確。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可能與感染、免疫異常、遺傳及精神等多種因素有關(guān)，多種促發(fā)因素作用于易感者，從而激發(fā)腸粘膜亢進(jìn)的免疫炎癥反應(yīng)。近年研究表明細(xì)胞因子、粘附分

2、子、核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)及其他炎性遞質(zhì)表達(dá)異常與UC發(fā)病關(guān)系密切。NF-κB是在進(jìn)化學(xué)上高度保守的一種轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各種組織中，能與許多細(xì)胞基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中的κB轉(zhuǎn)錄序列位發(fā)生特異性結(jié)合，在免疫和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)、病毒感染及某些疾病急性期反應(yīng)等方面起著重要作用。NF-κB在腸道炎癥過(guò)程中的中心調(diào)控作用，使其逐漸成為引人注目的新的炎癥性腸病治療靶點(diǎn)。已證明，許多UC臨床治療用藥如糖皮質(zhì)

3、激素、柳氮磺胺吡啶的藥理作用均與抑制NF-κB活性有關(guān)。糖皮質(zhì)激素對(duì)NF-κB的抑制正是其發(fā)揮廣泛抗炎作用的基礎(chǔ)。同時(shí)在臨床治療中發(fā)現(xiàn)相當(dāng)一部分患者對(duì)激素抵抗，效果欠佳，其機(jī)理不清。目前有關(guān)NF-κB在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制及激素抵抗中的意義研究尚未見(jiàn)系統(tǒng)研究報(bào)道。該研究通過(guò)觀察潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸粘膜組織中NF-κB表達(dá)水平及其與病情輕重、內(nèi)鏡分級(jí)、病理改變、病變部位之間的關(guān)系，并觀察NF-κB表達(dá)水平在潰瘍性結(jié)腸炎激素敏感組、激素抵抗組中

4、行激素治療前后的變化，探討NF-κB在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中及在激素抵抗中的意義，進(jìn)一步闡明潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療開(kāi)辟新的途徑。 方法： 第一部分NF-κB在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的意義研究 1.病例選擇：自2002年10月至2004年8月選擇我院門(mén)診及住院潰瘍性結(jié)腸炎患者34例，其中男性患者20例，女性患者14例，年齡17歲-70歲(平均41.2歲)，均為活動(dòng)期患者，作為實(shí)驗(yàn)組，檢測(cè)結(jié)腸病變粘膜組織中的

5、NF-κB表達(dá)水平。設(shè)立正常對(duì)照組26例。 2.主要試劑：鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體購(gòu)自SantaCruzbiotechnology公司，sp試劑盒，DAB顯色劑，EDTA抗原修復(fù)液(1mmol/l，PH8.0)購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。 3.免疫組織化學(xué)S-P二步法步驟：標(biāo)本制備；組織切片(4μm)常規(guī)脫蠟、水化，30ml/lH2O2浸泡，37℃15min；置EDTA抗原修復(fù)液中，95℃10min，自然冷卻至室溫

6、，PBS沖洗；滴加NF-κBp65單克隆抗體(1：250)，4℃過(guò)夜，37℃復(fù)溫60min，PBS沖洗；加生物素標(biāo)記的二抗，37℃12min，PBS沖洗，DAB顯色；沖洗，蘇木素復(fù)染，封片；結(jié)果判斷。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)錄入微機(jī)，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，將UC組病例與正常對(duì)照組的陽(yáng)性細(xì)胞染色積分所得數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)。所有分析顯著性水平α=0.05。 第二部分NF-κB在潰瘍性結(jié)腸炎激素抵抗

7、中的意義研究 1.病例選擇：自2002年10月至2004年8月選擇我院門(mén)診及住院的潰瘍性結(jié)腸炎患者35例，其中男18例，女17例，年齡20歲-65歲(平均38.4歲)。所有病例均為活動(dòng)期中度以上患者，均需應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療，給予強(qiáng)地松治療，每日劑量20-40mg,療程4周。根據(jù)激素治療反應(yīng)分為兩個(gè)組：病情緩解者為激素敏感組(glucocorticoidsensitive,CS)(n=20)和病情不緩解者為激素耐藥組(glucoc

8、orticoidresistant,CR)(n=15)，均作為實(shí)驗(yàn)組，檢測(cè)激素治療前、治療后結(jié)腸病變粘膜組織中的NF-κB表達(dá)水平。同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組16例，檢測(cè)正常結(jié)腸粘膜組織中的NF-κB表達(dá)水平。 2.主要試劑：鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體購(gòu)自SantaCruzbiotechnology公司，sp試劑盒，DAB顯色劑，EDTA抗原修復(fù)液(1mmol/l，PH8.0)購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。 3.免疫組織化學(xué)S

9、-P二步法步驟：標(biāo)本制備；組織切片(4μm)常規(guī)脫蠟、水化，30ml/lH2O2浸泡，37℃15min；置EDTA抗原修復(fù)液中，95℃10min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗；滴加NF-κBp65單克隆抗體(1：250)，4℃過(guò)夜，37℃復(fù)溫60min，PBS沖洗；加生物素標(biāo)記的二抗，37℃12min，PBS沖洗，DAB顯色；沖洗，蘇木素復(fù)染，封片；結(jié)果判斷。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)錄入微機(jī)，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，將UC

10、組病例與正常對(duì)照組的陽(yáng)性細(xì)胞染色積分所得數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)。所有分析顯著性水平α=0.05。 結(jié)果： 第一部分NF-κB在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的意義研究 1.NF-κBp65表達(dá)于UC患者結(jié)腸粘膜組織的表面上皮細(xì)胞、隱窩上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，及單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞內(nèi)，呈彌漫或顆粒性分布，多呈深棕黃色或褐色、粗顆粒狀分布。在水腫區(qū)和臨近潰瘍區(qū)的表面上皮、隱窩膿腫、隱窩上皮及上皮增生處表達(dá)明顯增

11、強(qiáng)。 2.大多數(shù)NF-κB的陽(yáng)性染色都表現(xiàn)在核內(nèi)，而僅有少量的NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)著色。 3.在正常組織NF-κBp65無(wú)或僅有弱陽(yáng)性表達(dá)，潰瘍性結(jié)腸炎組與正常對(duì)照組表達(dá)水平的比較(5.2±2.7vs1.0±0.9)，差異有顯著性(p＜0.01)。 4.NF-κBp65的表達(dá)強(qiáng)度與病情活動(dòng)性(病情輕重、內(nèi)鏡分級(jí)、組織學(xué)分級(jí)、病變部位)之間有一定關(guān)系。按病情輕重(Truelove-Witts標(biāo)準(zhǔn))分組，NF

12、-κBp65的表達(dá)在輕組與重組之間比較(3.5±2.0vs6.1±3.2)，P＜0.05，差異具有顯著性；內(nèi)鏡分級(jí)(Truelove標(biāo)準(zhǔn))之間關(guān)系，NF-κBp65的表達(dá)在Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)間比較(3.3±1.9vs5.7±2.4)，P＜0.05，Ⅰ級(jí)與Ⅲ級(jí)間比較(3.3±1.9vs7.3±3.5)，P＜0.01，差異具有顯著性；組織學(xué)分級(jí)(Truelove-Richards標(biāo)準(zhǔn))之間關(guān)系，NF-κBp65的表達(dá)在Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)間比較(3.7±2.

13、1vs5.9±2.4)，P＜0.05，Ⅰ級(jí)與Ⅲ級(jí)間比較(3.7±2.1vs7.4±4.0)，P＜0.01，差異具有顯著性；病變部位之間關(guān)系，NF-κBp65的表達(dá)在直乙狀結(jié)腸炎與全結(jié)腸炎間比較(4.5±2.5vs6.7±3.4)，P＜0.05，差異具有顯著性。 第二部分NF-κB在潰瘍性結(jié)腸炎激素抵抗中的意義研究 1.在正常結(jié)腸粘膜組織中，NF-κBp65無(wú)或僅有弱陽(yáng)性表達(dá)。在激素治療前，潰瘍性結(jié)腸炎激素敏感組、激素抵抗

14、組分別與正常對(duì)照組表達(dá)水平的比較(5.9±2.7vs1.1±0.8、6.1±2.9vs1.1±0.8)，差異有顯著性(p＜0.01)。 2.在激素治療前，NF-κBp65表達(dá)水平在激素敏感組和激素抵抗組之間比較(5.9±2.7vs6.1±2.9)，無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。在激素治療后，NF-κBp65表達(dá)水平在激素敏感組和激素抵抗組之間比較(1.3±0.8vs5.4±2.4)，具有顯著性差異(P＜0.01)。 3.

15、在激素治療前后，激素敏感組的NF-κBp65的表達(dá)水平比較(5.9±2.7vs1.3±0.8)，具有顯著差異性(P＜0.01)。而激素抵抗組在前后結(jié)果的比較中(6.1±2.9vs5.4±2.4)，無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。 結(jié)論： 1.在UC患者結(jié)腸粘膜組織中，NF-κB表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，提示NF-κB與UC關(guān)系密切，參與了UC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可能在UC的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。 2.NF-κB表達(dá)活性與UC的

16、病情活動(dòng)性及嚴(yán)重性(病情輕重、內(nèi)鏡分級(jí)、組織學(xué)分級(jí)、病變部位)有一定關(guān)系，其表達(dá)量也可作為判斷疾病程度的指標(biāo)之一。 3.大多數(shù)NF-κB的陽(yáng)性染色都表現(xiàn)在核內(nèi)，而僅有少量的NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)著色，說(shuō)明NF-κB活化形式主要存在于核內(nèi)。 4.正常對(duì)照組患者的結(jié)腸粘膜中幾乎檢測(cè)不到活化的NF-κB,說(shuō)明NF-κB只有在炎癥狀態(tài)下，才能被活化，而靜息狀態(tài)下，NF-κB以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。 5.NF-