腺病毒介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素與中藥組方對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠抗血管新生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究重組腺病毒介導(dǎo)的人內(nèi)皮抑素(recombinantadenovirusmediatinghumanendostatin，rAD-ES)與中藥組方對(duì)大鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(collagentypeⅡ-inducedarthritis，CIA)的血管新生及炎癥的影響。 研究對(duì)象：SD大鼠方法：首先，通過(guò)將帶有綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因的重組腺病毒(rAD-GFP-ES)感染

2、HEK-293A細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，并在熒光顯微鏡下借助GFP進(jìn)行監(jiān)控和篩選，收獲病毒，采用超速離心法純化病毒。用紫外分光光度法檢測(cè)重組腺病毒的滴度。 然后，用Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑(completeFreund'sAdjuvant，CFA)共同建立CIA模型，自造模次日開(kāi)始分別給予治療組rAD-GFP-ES(1×1011pfu·kg-1·week-1×4week)與中藥組方(40g·kg-1·day-1×4weeks)，模型對(duì)照

3、組分別給予等量的磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline，PBS)和對(duì)照病毒(rAD-GFP)，非模型組分別給予等量的rAD-GFP-ES和rAD-GFP。各組大鼠每周進(jìn)行一次AI評(píng)分，于造模第四周處死大鼠取膝關(guān)節(jié)進(jìn)行常規(guī)病理和免疫組織化學(xué)檢測(cè)其滑膜的微血管密度(microvesslesdensity,MVD)，心臟采血分離血清進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)大鼠體內(nèi)內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)、血管內(nèi)皮細(xì)胞

4、生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrixmetalloproteinase，MMP-3)的表達(dá)并計(jì)算相對(duì)含量。 結(jié)果：1、純化后的rAD-GFP-ES和rAD-GFP滴度分別為：6.6×1012pfu·mL-1，4.8×1012pfu·mL-1；OD260nm/OD280nm均＞1.3，病毒滴度及純度均可滿足實(shí)驗(yàn)需要。 2、感染rAD-GFP-

5、ES的大鼠血清中ES獲得了穩(wěn)定的表達(dá)，其濃度是正常大鼠血清含量的2.4倍。 3、感染rAD-GFP-ES與中藥組方對(duì)AI評(píng)分的影響rAD-GFP-ES治療組的AI評(píng)分明顯低于模型組，中藥組方也能降低AI評(píng)分，但其程度不如rAD-GFP-ES治療組顯著。 4、感染rAD-GFP-ES與中藥組方對(duì)CIA大鼠滑膜血管新生的影響CIA模型大鼠的滑膜組織增生，新生血管數(shù)目明顯增加；rAD-GFP-ES可以使滑膜新生血管數(shù)目明顯減少

6、，同時(shí)能降低VEGF和MMP-3的表達(dá)；中藥組方對(duì)滑膜MVD有輕度影響，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，能明顯抑制VEGF的表達(dá)，而對(duì)MMP-3沒(méi)有明顯影響。 結(jié)論：1、通過(guò)rAD-GFP-ES注射可使ES基因在大鼠體內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)。 2、感染rAD-GFP-ES能明顯降低模型大鼠的AI評(píng)分。 3、VEGF和MMP-3共同促進(jìn)CIA大鼠滑膜血管新生和炎癥的形成和發(fā)展，rAD-GFP-ES可能通過(guò)抑制VEGF和MMP-3的表達(dá)而發(fā)