肝細(xì)胞癌組織中抑癌基因KLF6的變異、表達(dá)及其功能的研究.pdf

1、在世界范圍內(nèi)慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirusHBV)感染是肝細(xì)胞癌發(fā)生的主要病因之一，在我國(guó)絕大多數(shù)肝細(xì)胞癌的發(fā)生則均與HBV持續(xù)感染有關(guān)，HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌已是我國(guó)腫瘤人群死亡的主要原因。雖然已知HBV感染能從多個(gè)環(huán)節(jié)參與HCC的發(fā)病，但確切的分子機(jī)制至今尚未完全清楚。目前認(rèn)為肝細(xì)胞癌的發(fā)生是眾多控制細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育位點(diǎn)的基因功能異常積累的結(jié)果，是一個(gè)多基因參與、多步驟、多階段的病理學(xué)過程，其中抑癌基因或/和癌基因功能異

2、常在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。至今已發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因或癌基因與肝癌密切相關(guān)，如p53、Rb、p16INK等抑癌基因常因發(fā)生基因缺失、突變或啟動(dòng)子甲基化而功能失活。大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌通常存在多個(gè)抑癌基因的異常，而現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的抑癌基因異常僅能解釋部分肝癌的發(fā)生，尚有未知的抑制癌基因存在。目前，新抑癌基因的發(fā)現(xiàn)及其功能研究已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，因?yàn)檫@不僅能進(jìn)一步揭示肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，而且也有助于發(fā)現(xiàn)新的治療方法。 Kr

3、uppel樣因子6(Kruppel-likefactor6KLF6)是近年新發(fā)現(xiàn)的廣泛表達(dá)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子。與一般的轉(zhuǎn)錄因子一樣，KLF6含一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)激活結(jié)構(gòu)域，其DNA結(jié)構(gòu)域位于C末端，含三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，與Kruppel樣家族成員有著高度同源性，而N端激活結(jié)構(gòu)域功能各異。已知的KLF家族轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖、生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡和血管生產(chǎn)工具等生理過程。Narta等首先發(fā)現(xiàn)至少70％前列腺癌組織中KL

4、F6基因雜合性缺失(LOH)或/和突變，由于KLF6具有抗細(xì)胞增殖的特性，因此被認(rèn)為是新的候選抑癌基因。隨后在結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、鼻咽癌等其他腫瘤中均發(fā)現(xiàn)KLF6基因不同程度LOH或突變，并且在非小細(xì)胞性肺癌、食道癌中發(fā)現(xiàn)KLF6mRNA表達(dá)水平明顯下降。目前KLF6基因抑癌作用的確切機(jī)制尚不清楚，但現(xiàn)有資料表明KLF6基因失活在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。 通常抑癌基因失活的分子機(jī)制是由于其內(nèi)部一個(gè)等位基因突變另一個(gè)等位

5、基因缺失即雜合性缺失(LOH)引起。而基因突變或LOH的發(fā)生主要與染色體的不穩(wěn)定性有關(guān)。研究表明，中、低度分化的肝細(xì)胞癌細(xì)胞的10號(hào)染色體存在高度不穩(wěn)定性，因此在該染色體上可能存在著與肝癌相關(guān)的腫瘤抑制基因。Kremer-Tal等報(bào)道49％(20/41)肝細(xì)胞癌組織存在KLF6基因雜合性缺失或/和突變，提示KLF6基因在肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮一定作用；然而另一研究結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌組織并不存在KLF6基因的突變。因此肝細(xì)胞癌組織中K

6、LF6基因突變及其作用還需進(jìn)一步研究。目前關(guān)于KLF6基因在肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平的研究尚少有報(bào)道。而關(guān)于KLF6基因在DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用的研究至今尚無報(bào)道。本研究的意義旨在通過揭示KLF6基因失活在肝細(xì)胞癌發(fā)病中的作用及可能機(jī)制，為尋找新的治療策略提供理論基礎(chǔ)。 第一部分肝細(xì)胞癌組織中Kruppel樣因子6(KLF6)基因的變異及其抗細(xì)胞增殖功能的改變 研究目的 了解肝細(xì)胞癌組織中KLF6基因突變的發(fā)生

7、情況，同時(shí)進(jìn)一步研究基因突變對(duì)KLF6抗肝癌細(xì)胞增殖功能的影響及可能機(jī)制。 方法 以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增肝細(xì)胞癌及其癌旁組織KLF6基因外顯子2序列，對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向序列測(cè)定。采用分子克隆和PCR定位突變技術(shù)構(gòu)建野生型及突變型KLF6真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選建立KLF6穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞系(HepG2-KLF6)，采用流式細(xì)胞術(shù)及MTT試驗(yàn)觀察KLF6基因?qū)epG2細(xì)胞增殖活

8、性及細(xì)胞周期的影響。以Westernblot技術(shù)檢測(cè)外源KLF6基因?qū)epG2細(xì)胞P21WAF1表達(dá)的影響。 結(jié)果 1.23例肝細(xì)胞癌組織中2例(8.6％)出現(xiàn)KLF6基因突變，其中一例導(dǎo)致氨基酸改變(W162G)。 2.成功構(gòu)建野生型(pcDNA3.1(-)A/wtKLF6)和突變型(pcDNA3.1(-)A/mtKLF6)KLF6真核表達(dá)質(zhì)粒。 3.建立了野生型和突變型KLF6穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞

9、系。 4.與空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)A穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞相比，wtKLF6穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢，細(xì)胞周期G0-G1期所占細(xì)胞的比例明顯增高(P＜0.01)，P21WAF1蛋白表達(dá)水平明顯升高。而mtKLF6穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞與空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)A穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞相比無明顯變化。 結(jié)論 1.肝細(xì)胞癌組織中存在KLF6基因突變。 2.錯(cuò)義突變使KLF6基因失去了抗細(xì)胞增殖

10、的功能，誘導(dǎo)P21WAF1基因表達(dá)能力的下降可能是其失去抗細(xì)胞增殖能力的重要原因。 3.KLF6基因突變?cè)诟渭?xì)胞癌發(fā)生過程中可能起到一定作用。 第二部分肝細(xì)胞癌組織中KLF6基因的表達(dá)及其在DNA損傷誘導(dǎo)調(diào)亡中的作用 研究目的 了解肝細(xì)胞癌組織中KLF6基因的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究KLF6基因在DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡中的作用. 方法 以Westernblot方法測(cè)定23例肝細(xì)胞癌及其癌旁組織

11、和肝癌細(xì)胞株中KLF6蛋白的表達(dá)水平，采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)、RT-PCR及Westernblot等方法觀察順鉑作用下KLF6蛋白亞細(xì)胞定位和KLF6基因表達(dá)的變化。以不同濃度順鉑作用于KLF6穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞(HepG2-KLF6)，采用MTT法測(cè)定HepG2-KLF6細(xì)胞對(duì)順鉑的反應(yīng)，以TUNEL法流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2-KLF6細(xì)胞凋亡，同時(shí)采用RT-PCR、Westernblot技術(shù)分別對(duì)順鉑作用下HepG2-KLF6細(xì)胞

12、P21WAF1、Caspase-3基因的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定。 結(jié)果 1.23例肝細(xì)胞癌組織中9例(39.1％)KLF6蛋白水平低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織或正常肝組織，其中5例表達(dá)異常的KLF6蛋白。在檢測(cè)的肝癌細(xì)胞株中HepG2、SMMC-7721細(xì)胞KLF6蛋白表達(dá)水平較低。 2.在5μg順鉑作用12小時(shí)條件下，HepG2細(xì)胞中KLF6蛋白轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，隨著順鉑作用時(shí)間延長(zhǎng)(6h、12h、24h)，KLF6mRNA和蛋白

13、水平逐步升高。 3.隨著順鉑作用濃度的增加(2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、15.0μg/ml)或作用時(shí)間的延長(zhǎng)(24h、48h、72h)，MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，KLF6穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞的存活率明顯低于對(duì)照組HepG2-vector細(xì)胞(P＜0.05)。在低濃度(1.3μg/ml)順鉑作用24h的條件下，HepG2-KLF6細(xì)胞生存率高于對(duì)照組細(xì)胞。 4.不同濃度順鉑(5.0μg/ml，10

14、.0μg/ml，15.0μg/ml)作用24小時(shí)條件下，TUNEL法流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，KLF6穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞凋亡程度明顯高于對(duì)照組HepG2-vector細(xì)胞(P＜0.05)。 5.不同濃度順鉑作用24小時(shí)條件下，隨著順鉑作用濃度的增加(5.0μg/ml，10.0μg/ml，15.0μg/ml)，HepG2-KLF6細(xì)胞P21WAF1和Cleaved-caspase3蛋白水平明顯高于對(duì)照HepG2-vector細(xì)胞

15、，對(duì)照HepG2-vector細(xì)胞Procaspase-3蛋白水平明顯下降，而HepG2-KLF6細(xì)胞Procaspase-3蛋白水平無顯著變化。與P21WAF1蛋白水平的變化一致，隨著鉑濃度增高，P21WAF1mRNA水平亦隨之升高，并且HepG2-KLF6細(xì)胞P21WAF1mRNA水平高于對(duì)照HepG2-vector細(xì)胞，HepG2-KLF6細(xì)胞Procaspase-3mRNA水平逐步升高，而HepG2-vector細(xì)胞Procas