PRL-3上調(diào)VEGF、VEGF-C表達(dá)并與肺癌的MVD、LVD呈正相關(guān).pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文PRL3上調(diào)VEGF、VEGFC表達(dá)并與肺癌的MVD、LVD呈正相關(guān)姓名：陶娟申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：邱雪杉20090401％C02條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期呈單層亞融合狀態(tài)，加入含不同處理因素的培養(yǎng)液，在不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞。2、方法21WesternBlot法：在收集的細(xì)胞或組織內(nèi)加入裂解液充分裂解，低溫高速離心，提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60ug。電泳(12％SDSPAGE

2、凝膠)、轉(zhuǎn)印(50V，120min)、5％正常小牛血清封閉，一抗ERKl／2(1：200)、PERK(1：200)，13actin(1：200)，VEGF(1：100)、VEGFC(1：200)，4“C孵育過(guò)夜，分別與各自對(duì)應(yīng)的二抗(1：2500，chemicon，USA)室溫孵育2h，DAB顯色，結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀(ChemiImager5500，AlphaInnotechUSA)采集，進(jìn)行灰度值測(cè)定。22細(xì)胞遷移和侵襲能力

3、檢測(cè)在transwell小室(Corning公司)下室加入600ul含10％d、牛血清DMEM培養(yǎng)基，上室中加入100ul無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，接種A549細(xì)胞數(shù)為25104個(gè)。37“C、5％C0。孵箱中培養(yǎng)6hr后吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗后，甲醇室溫固定15min，用棉簽輕擦掉微孔膜上表面的細(xì)胞，蘇木素染色，室溫干燥過(guò)夜。取下微孔膜，置載玻片上，鏡下觀察。細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定用預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基以1：7稀釋Matrigel(BDBiose

4、iences，USA)加入上室100ul，在室溫下放置6h。使用前用培養(yǎng)基重新水化并吸凈，其他與遷移實(shí)驗(yàn)相同，培養(yǎng)18hr后觀察結(jié)果。23逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT—PCR)：提取細(xì)胞總RNA，按RTPCR(TaKaRa)試劑盒方法進(jìn)行反應(yīng)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。24MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率的變化，以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對(duì)照，重復(fù)3次，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，重