HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的相關(guān)性研究.pdf

1、子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有的嚴(yán)重并發(fā)癥，在我國發(fā)病率為9.4％，國外報(bào)道7％～12％。以妊娠20周后高血壓、蛋白尿和水腫為特征，并伴有全身多系統(tǒng)損害，同時常伴有胎兒生長受限。該病嚴(yán)重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍生兒發(fā)病及死亡的主要原因之一。
　　 子癇前期的病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，是國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)。目前公認(rèn)可能與以下四種學(xué)說有關(guān)：遺傳易感性、免疫適應(yīng)不良、胎盤缺血、氧化應(yīng)激反應(yīng)。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)

2、果提示，遺傳易感性及免疫適應(yīng)不良可能相互影響，共同參與了子癇前期的發(fā)病。圍繞這一中心思想，對引起移植排斥反應(yīng)的最主要的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)系統(tǒng)進(jìn)行研究，篩選子癇前期的HLA系統(tǒng)易感基因位點(diǎn)，成為研究子癇前期的免疫遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制的一條重要思路。
　　 HLA-G表達(dá)減少的機(jī)制可能與HLA-G基因5’上游調(diào)控區(qū)(5’-upstreamregulatore region，5’-URR

3、)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)相關(guān)。SNP是指存在于某一(些)群體、正常個體的基因組DNA中單個堿基的差異，是人類遺傳信息多態(tài)性的本質(zhì)表現(xiàn)。其具有數(shù)目多、分布廣，相對穩(wěn)定的存在于染色體上等特點(diǎn)。SNP的產(chǎn)生可能會引起蛋白質(zhì)表型的改變，所以SNP也是影響人類體質(zhì)的關(guān)鍵，使人可能特別易于或特別不易患上某些疾病。本研究從SNP角度研究重度子癇前期的基因背景，推測HLA-G基因上游調(diào)控

4、區(qū)可能存在導(dǎo)致重度子癇前期發(fā)病的某(幾)個SNP易感位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的堿基變化導(dǎo)致了HIA-G蛋白在母胎界面的表達(dá)發(fā)生變化，從而打破了母胎間的免疫耐受，導(dǎo)致重度子癇前期的發(fā)病。
　　 考慮到HLA-G在妊娠過程中的重要作用，及其作為一種可能誘導(dǎo)免疫耐受的分子在臨床中的潛在應(yīng)用價(jià)值，分析其表達(dá)影響因素將有助于深入了解HLA-G的分子生物學(xué)特性，并為臨床實(shí)踐提供有價(jià)值的信息。
　　 目的
　　 本研究收集河南漢族重度子

5、癇前期人群及正常妊娠婦女外周血，采取直接測序法計(jì)算HLA-G基因5’-URR SNP位點(diǎn)等位基因及基因型頻率，比較各SNP在重度子癇前期組和正常妊娠組間的分布差異。從免疫遺傳學(xué)角度，分析研究HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)SNP與重度子癇前期的關(guān)系，探討HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。
　　 材料與方法
　　 1研究對象
　　 重度子癇前期患者39例，平均年齡(31.17±5.97)歲，平均孕周(33.93±3.

6、53)周；病人來自2008年10月至2009年3月鄭州大學(xué)第三臨床學(xué)院產(chǎn)科。重度子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照樂杰主編《婦產(chǎn)科學(xué)》(第7版)。選取同期孕晚期正常足月妊娠婦女43例為對照組，平均年齡(29.82±5.07)歲，平均孕周(38.87±1.01)周。兩組孕婦孕前均無高血壓、心臟病、腎病、肝病及糖尿病史，無輸血及免疫治療病史。所有研究對象均隨訪至產(chǎn)后12周。
　　 本研究經(jīng)我院倫理委員會審批通過并獲得參與者的知情同意。
　　

7、 2實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1標(biāo)本采集
　　 于剖宮產(chǎn)術(shù)前采集重度子癇前期組孕婦和正常晚孕組孕婦肘靜脈血2mL，以3.8％的枸櫞酸鈉抗凝，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采集納入者個人信息及病史資料，建立數(shù)據(jù)庫。
　　 2.2基因組DNA的提取
　　 采用鹽析法。將-20℃保存的抗凝全血在室溫狀態(tài)下逐漸溶解。取抗凝全血500μl于已滅菌的1.5mlEppendorf管，加紅細(xì)胞裂解液(本實(shí)驗(yàn)用三蒸水)900μl，顛

8、倒混勻，4000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，棄上清，重復(fù)以上步驟2-3次，直至沉淀層無色。移去上清，加白細(xì)胞裂解液370μl(蛋白酶K終濃度為750μg/ml，SDS至終濃度為1.0％)，用振蕩器將沉淀打碎，55℃水浴30分鐘。待冷卻至室溫加100μl飽和NaCl，充分混勻15秒，13，000轉(zhuǎn)/分離心6分鐘。將離心后的上清轉(zhuǎn)入另一滅菌的1.5mlEppendorf管中，然后離心13，000轉(zhuǎn)/分3分鐘。再將離心后的上清轉(zhuǎn)入另一滅菌的1.5mlE

9、ppendorf管中，加無水乙醇1ml，輕輕顛倒幾次，離心13，000轉(zhuǎn)/分6分鐘。離心后倒去上清液加70％乙醇500μl，顛倒混勻13，000轉(zhuǎn)/分離心6分鐘。在雙人凈化工作臺中倒去上清，并使Eppendorf管壁附著的DNA自然風(fēng)干，加三蒸水50μl。用紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度、純度，并調(diào)整DNA濃度為100μg/ml。標(biāo)本置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.3 HLA-G5’-URR的特異性擴(kuò)增
　　 采用巢式

10、聚合酶鏈反應(yīng)(nested polymerase chain reaction，nPCR)特異性擴(kuò)增HLA-G5’-URR片斷。根據(jù)美國國立生物信息中心(National Center for Bio-technology Information，NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫中人HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)(L36549.1，目的基因)及人β肌動蛋白(NC_000006.11，內(nèi)參照基因)序列，采用Primer3 Input(versio

11、n0.4.0)設(shè)計(jì)引物，其中β肌動蛋白為內(nèi)、外巢兩次PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參照引物。外巢引物序列：上游5’-TGGGTGCTGTTTAAAGCCAAT-3'，下游5’-CCCCGAGAGTAGCAGGAAGA-3’，擴(kuò)增片段1761bp；內(nèi)巢引物序列：上游5’-AGCAGGAGGTGAGGAAAAGG-3’，下游5'-CCTTGGTAACCCCTGAATGA-3’，擴(kuò)增片段593bp；β肌動蛋白內(nèi)參照引物序列：上游5’-TGCCAAGTG

12、GAGCACCCAA-3’，下游5’-GCATCTTGCTCTGTGCAGAT-3，擴(kuò)增片段785bp。內(nèi)參照基因與目的基因分管擴(kuò)增，作為陽性對照；以三蒸水為模板進(jìn)行擴(kuò)增，作為陰性對照；以上陽性對照、陰性對照作為實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量控制。PCR反應(yīng)各組分添加均在超凈工作臺中、冰上進(jìn)行。
　　 2.3.1外巢反應(yīng)
　　 10μl反應(yīng)體系包括以下成分：5×PrimerStar Buffer2μl，2.5mM dNTP0.8μl，上下

13、游引物10μM各0.2μl，5×Primerstar酶0.1μl，基因組DNA0.7μl，三蒸水加至10μl。
　　 擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置：98℃變性10s，65℃退火8s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)。4℃保存。
　　 2.3.2內(nèi)巢反應(yīng)
　　 50μl反應(yīng)體系包括以下成分：5×PrimerStar Buffer10μl，2.5mM dNTP4μl，上下游引物10μM各1μl，5×PrimerStar酶0.5μl，

14、外巢產(chǎn)物稀釋10倍后取3μl，三蒸水加至50μl。
　　 擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置：98℃變性10s，67℃退火8s，72℃延伸50s，5個循環(huán)；98℃變性10s，65℃退火8s，72℃延伸50s，5個循環(huán)；98℃變性10s，63℃退火8s，72℃延伸50s，5個循環(huán)；98℃變性10s，61℃退火8s，72℃延伸50s，20個循環(huán)。共35個循環(huán)。4℃保存。
　　 2.4 PCR產(chǎn)物電泳
　　 取內(nèi)巢產(chǎn)物1μl，6×溴酚蘭上樣

15、緩沖液1μl，0.5×TBE電泳緩沖液4μl，吸吹混勻，加樣于1％瓊脂糖凝膠中(已采用GOLDVIEW核酸染料處理)，電壓120V電泳25分鐘。采用天根公司100bp ladder為DNA Maker，于紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果，并用凝膠成像分析系統(tǒng)攝片保存。
　　 PCR擴(kuò)增成功的電泳圖判定標(biāo)準(zhǔn)：Ladder電泳條帶清晰；電泳圖背景較清晰；目的片斷、內(nèi)參片斷較清晰，電泳位置符合預(yù)期的核酸片斷大小，所在泳道無非特異擴(kuò)增帶及拖尾現(xiàn)象；

16、陰性對照泳道無核酸片斷。
　　 本實(shí)驗(yàn)HLA-G5’-URR目的片斷擴(kuò)增成功。所擴(kuò)增目的基因?yàn)?93bp，電泳圖中可見目的基因電泳位置在ladder所示的600bp略遠(yuǎn)處，內(nèi)參照片斷(785bp)在800bp略遠(yuǎn)處，陰性對照無條帶，電泳結(jié)果初步判定目的基因擴(kuò)增成功。
　　 2.5 PCR產(chǎn)物純化
　　 經(jīng)電泳初步確認(rèn)目的條帶擴(kuò)增成功后，制備厚膠板，將剩余PCR產(chǎn)物再次電泳(120V，25min)，并在紫外燈下切膠

17、回收目的DNA片斷。具體實(shí)驗(yàn)過程可參照大連寶生物工程有限公司瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(DV805A)的說明書進(jìn)行。
　　 純化后產(chǎn)物采用紫外分光光度計(jì)測量濃度、純度，并冰盒保存送英濰捷基生物公司測序。
　　 2.6純化后PCR產(chǎn)物測序
　　 英濰捷基生物公司根據(jù)Sanger雙脫氧鏈法測序原理，采用ABI3730測序儀進(jìn)行測序。測序引物采用內(nèi)巢下游引物，進(jìn)行反向測序，即測序圖中所讀堿基序列為目的片斷在GenBank

18、中登陸序列(登錄號L36549.1)的反向互補(bǔ)序列。
　　 2.7測序圖的分析
　　 測序后所得序列用Chromas、DNASTAR軟件核對、分析，并人工核對堿基判讀結(jié)果，減少測序儀誤差。所得序列反向互補(bǔ)后在GenBank中BLAST，尋找SNP位點(diǎn)。
　　 經(jīng)比對，本研究擴(kuò)增片段與HLA-G基因上游調(diào)控區(qū)相應(yīng)片斷大致符合，存在8個單核苷酸的多態(tài)性位點(diǎn)。
　　 本研究采用高保真的DNA聚合酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信

19、；且測序圖背景清晰，測序結(jié)果滿意。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行；應(yīng)用擬合優(yōu)度x2檢驗(yàn)判斷基因型的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法；等位基因的頻率分布差異采用列聯(lián)表x2檢驗(yàn)，對不適合x2驗(yàn)條件的數(shù)據(jù)用Fisher精確概率法計(jì)算P值。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1一般臨床資料比較
　　 分析重度子癇前

20、期組和正常晚孕組孕婦臨床資料，進(jìn)行比較可知兩組孕婦的年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，孕周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2各SNP位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡分析
　　 本研究對中國河南地區(qū)漢族重度子癇前期患者39例和正常晚孕婦女43例HLA-G基因5’-URR片段進(jìn)行測序，并分析-1155bp至-716bp之間單核苷酸位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果顯示：共檢測到8個SNP，分別為-1179A/G(rs

21、1736935)、-1155G/A(rs3823321)、-1140A/T(rs1736934)、-964G/A(rs1632947)、-762C/T(rs1632946)、-725C/G(rs1233334)、-716T/G(rs2249863)、-689A/G(rs2735022)，其中-725位點(diǎn)未檢測到T等位基因和GG基因型，與相關(guān)報(bào)道不同。-1179A/G、-1155G/A、-689A/G位于測序圖兩端，其測序結(jié)果的準(zhǔn)確性欠佳

22、，本文暫不分析。對-1140A/T、-964G/A、-762C/T、-725C/G、-716T/G進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡分析顯示，正常對照組與病例組標(biāo)本代表性較好(x2=0.01～2.11，P>0.05)，提示其在兩組孕婦中的分布平衡，來自同一孟德爾群體。
　　 在本研究檢測的片斷中尚有2個以往報(bào)道發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)，在本研究中未表現(xiàn)出多態(tài)性，分別是-1138位點(diǎn)(rs17875389)、-1121位點(diǎn)(rs31

23、15630)。
　　 3重度子癇前期和正常晚孕組孕婦HLA-G5’-URR SNP基因型和等位基因頻率分布比較
　　 比較HLA-G5’-URR-1140A/T、-964G/A、-762C/T、-725C/G、-716T/G的基因型及等位基因在重度子癇前期和正常晚孕組的分布顯示：-964位點(diǎn)GG、GA、AA基因型在重度子癇前期組中的頻率分別為15.4％、48.7％、35.9％，正常晚孕組中頻率分別為37.2％、39.5％

24、、23.3％，分布差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；-964位點(diǎn)G、A等位基因在重度子癇前期組中的頻率分別為39.7％、60.3％，正常晚孕組中頻率分別為57.0％、43.0％，分布差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。-716位點(diǎn)GG、GT、TT基因型在重度子癇前期組中的頻率分別為38.5％、43.6％、17.9％，正常晚孕組中頻率分別為20.9％、37.2％、41.9％，分布差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；-716位點(diǎn)G、T等位

25、基因在重度子癇前期組中的頻率分別為60.3％、39.7％，正常晚孕組中頻率分別為39.5％、60.5％，分布差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。-1140A/T、-762C/T、-725C/G的基因型及等位基因在重度子癇前期和正常晚孕組的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 在河南漢族育齡婦女中，-716、-964位點(diǎn)基因型和等位基因分布在重度子癇前期組和正常妊娠組間存在差異，提示HLA-G基因5'