姜黃素防治小鼠實驗性急性壞死性胰腺炎的研究.pdf

1、目的：
　　 急性壞死性胰腺炎(Acute Necrotizing Paacreatitis,ANP)是一種常見臨床急腹癥，病程進(jìn)展快，病死率高，治療困難。ANP時往往伴隨核因子-kB(nuclearfactor-kappa B,NF-κB)表達(dá)的增加和活化，以及各種炎癥反應(yīng)因子的表達(dá)和釋放，NF-κB的活化是ANP發(fā)生發(fā)展以及全身炎癥反應(yīng)級聯(lián)擴大的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而抑制NF-κB的活化可以減少炎癥因子的表達(dá)和釋放，減輕炎癥反應(yīng)，對A

2、NP的防治有重要意義。姜黃素是從草本植物姜黃的根莖中提取出來的一種酚類色素，可通過干擾轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化、抑制炎癥介質(zhì)的釋放而發(fā)揮抗炎效應(yīng)，并且該作用可能與其上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activatedreceptorΥ，PPARΥ)有關(guān)。本課題旨在探討姜黃素對雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠急性壞死性胰腺炎的預(yù)防保護作用，并通過體內(nèi)和體外實驗進(jìn)一步研究姜黃素對NF-κB和PPARΥ途徑的影響

3、，以闡明其作用機制。
　　 方法:
　　 1、體內(nèi)實驗：80只健康Kun Ming小鼠被隨機分為4組，急性壞死性胰腺炎模型組小鼠腹腔注射雨蛙素造成急性壞死性胰腺炎(ANP)；姜黃素干預(yù)組小鼠腹腔注射姜黃素，劑量為50mg/kg，連續(xù)注射6天，然后腹腔注射雨蛙素造成ANP；對照組小鼠使用生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。另外，一個單獨的動物組使用PPARΥ的拮抗劑GW9662，伴隨姜黃素同時注射，注射方法為尾靜脈注射，劑量為0.3 m

4、g/kg。各組在造膜成功后10h采集血樣并處死小鼠，測定血清淀粉酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartase aminotransferase,AST)的活性。ELISA雙夾心技術(shù)檢測血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平和白介素6(interukin，IL-6)水平。觀察胰腺病理損傷情況，胰腺組織石蠟切片常規(guī)HE

5、染色，進(jìn)行鏡下病理評分：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測胰腺組織PPARΥ mRNA的表達(dá)，Western-blot法檢測胰腺組織NF-κBp65、PPARΥ蛋白的表達(dá)。
　　 2、體外實驗：體外培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，以LPS作為炎性刺激物，研究姜黃素的抗炎作用。LPS誘導(dǎo)組，每孔加入終濃度為O.1μg/ml

6、的LPS；姜黃素干預(yù)組，每孔加入終濃度為100μmol/ml的姜黃素，37℃培養(yǎng)2h后，每孔再加入終濃度為0.lμg/ml的LPS。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測巨噬細(xì)胞PPARΥ mRNA的表達(dá)并用Western-blot法檢測NF-κB p65、PPARΥ蛋白的表達(dá)水平，ELISA雙夾心技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α水平和IL-6水平。
　　 結(jié)果
　　 1、姜黃素對ANP小鼠血清淀粉酶和轉(zhuǎn)氨酶(A

7、LT/AST)活性的影響
　　 誘導(dǎo)ANP后10h ANP組小鼠血清淀粉酶、ALT、AST活性比對照組顯著增高(P<0.01)；而姜黃素處理組ANT小鼠血清淀粉酶、ALT、AST活性則比ANP組有顯著下降(P<0.05)。
　　 2、小鼠胰腺組織干濕比重變化
　　 誘導(dǎo)ANP后10h，ANP組小鼠胰腺組織含水量比對照組顯著增高(p<0.01)；而姜黃素處理組小鼠的胰腺組織含水量則比ANP組有顯著降低(P<0.05

8、)。
　　 3、胰腺組織病理學(xué)特征及病損程度檢查結(jié)果
　　 對照組胰腺無明顯病理改變，小葉完整，間質(zhì)清晰，間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤不明顯，無出血壞死；與對照組相比，ANP組小鼠可見胰腺出血、滲出，胰泡間彌漫性擴張，胰腺細(xì)胞壞死，小葉間及血管周圍白細(xì)胞侵潤，病理學(xué)評分較對照組明顯升高；而姜黃素處理組胰腺細(xì)胞壞死率及炎性細(xì)胞侵潤程度較ANP組明顯減輕，病理學(xué)評分明顯降低。其中，病理評分是按照Schmidt評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分并計算其平

9、均值。
　　 4、姜黃素對TNF-α表達(dá)和釋放的影響
　　 誘導(dǎo)ANP后10h,小鼠血清中TNF-α水平比對照組顯著升高(P<0.05)，經(jīng)姜黃素處理組TNF-α水平較ANP模型組顯著下降（p<0.05）；而在體外實驗中，與未受刺激的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液比較，LPS刺激后TNF-α表達(dá)和釋放明顯升高（P<0.05），用100μmol/ml姜黃素處理后TNF-α釋放較LPS組有明顯下降(p<0.05)。
　

10、　 5、姜黃素對ID6表達(dá)和釋放的影響
　　 誘導(dǎo)ANP后10h，小鼠血清中IL-6水平比對照組顯著提高(P<0.05)，經(jīng)姜黃素處理組IL-6水平較ANP模型組顯著下降（P<0.05）；而在體外實驗中，與未受刺激的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液相比，LPS刺激后IL-6釋放明顯增加(p<0.05)，用100μmol/ml姜黃素處理后IL-6釋放較LPS組有明顯降低(p<0.05)。
　　 6、姜黃素對NF-KB活性的

11、影響
　　 采用Western blot法檢測胰腺組織和巨噬細(xì)胞RAW264.7核蛋白中NF-κBp65的水平。在體內(nèi)實驗中，對照組胰腺組織細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白水平較低，幾乎檢測不到；ANP組NF-κB p65核蛋白的水平明顯升高(P<0.05)；而姜黃素處理組NF-κB p65核蛋白的水平較ANP組明顯降低（P＜0.05）。體外實驗中，在未受刺激的RAW264.7細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白水平較低，用LPS刺激細(xì)

12、胞后，其NF-κB p65核蛋白的水平明顯升高(P<0.05)：而用100μmol/ml姜黃素處理后，細(xì)胞核NF-κB p65蛋白的水平較LPS組明顯下降(P<0.05)。
　　 7、姜黃素對PPARΥ表達(dá)的影響
　　 體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，在造成ANP后，胰腺組織中PPARΥ的表達(dá)無論在轉(zhuǎn)錄水平還是在蛋白水平與對照組相比都有所下降(P<0.05)，而經(jīng)過姜黃素處理的實驗組，PPARΥ在這兩個水平上的表達(dá)都有顯著提高(p＜0

13、.05)。在體外研究中，RAW264.7細(xì)胞受到LPS刺激后，PPARΥ的表達(dá)無論在轉(zhuǎn)錄水平還是在蛋白水平均比未受刺激的細(xì)胞有所下降(P<0.05)，而用100μmol/ml姜黃素處理后，PPARΥ在這兩個水平上的表達(dá)則顯著提高(p＜0.05)。
　　 8、PPARΥ拮抗劑GW9662的作用
　　 為了進(jìn)一步闡明姜黃素防治ANP的作用是否與激活PPARΥ途徑有關(guān)，在胰腺炎模型小鼠進(jìn)行姜黃素處理的同時尾靜脈注射PPARΥ的

14、特異性拮抗劑GW9662。實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用GW9662可以部分消除姜黃素對小鼠血清淀粉酶、ALT、AST、TNF-α、IL-6的影響。NF-κB的Western blot結(jié)果顯示，應(yīng)用GW9662后姜黃素對核蛋白中NF-κB p65的下調(diào)作用減弱，差異顯著（P<0.05）。
　　 結(jié)論
　　 1.姜黃素對小鼠急性壞死性胰腺炎胰腺及肝臟損傷有一定的預(yù)防保護作用；
　　 2.姜黃素可通過活化PPARΥ途徑而抑制NF