bFGF-雙層膠原基復(fù)合材料修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損及其相關(guān)研究.pdf

1、創(chuàng)傷修復(fù)過程是多種生長(zhǎng)因子協(xié)調(diào)的時(shí)空控制過程。應(yīng)用外源性生長(zhǎng)因子在組織修復(fù)過程中顯示了較好的應(yīng)用前景，但是實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子的時(shí)空控制，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷組織的再生修復(fù)，仍然存在著巨大的挑戰(zhàn)。組織工程方法的出現(xiàn)，為解決組織修復(fù)提供了一個(gè)新的途徑。構(gòu)建具有時(shí)空控制釋放特點(diǎn)的載生長(zhǎng)因子組織工程支架已成為一個(gè)新的研究方向。時(shí)空控制釋放生長(zhǎng)因子體現(xiàn)了生長(zhǎng)因子釋放的兩個(gè)特點(diǎn)：1．所釋放的生長(zhǎng)因子聚集與創(chuàng)傷組織局部，作用于相應(yīng)的靶組織和細(xì)胞，并避免釋放于周圍組

2、織引起的不可預(yù)期結(jié)果；2．生長(zhǎng)因子釋放應(yīng)該持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，滿足組織再生修復(fù)的需求。
　　 生長(zhǎng)因子的釋放與支架材料的結(jié)構(gòu)存在一定的相關(guān)性。通過調(diào)整支架材料的疏松或致密結(jié)構(gòu)，可以改變所負(fù)載生長(zhǎng)因子的釋放行為。據(jù)此，本研究設(shè)計(jì)制備一種具有雙側(cè)疏松或致密程度不同的雙層結(jié)構(gòu)材料，以期通過材料的結(jié)構(gòu)差異調(diào)整生長(zhǎng)因子的釋放行為，實(shí)現(xiàn)所負(fù)載生長(zhǎng)因子的時(shí)空控制釋放。并將所制備材料應(yīng)用于傳統(tǒng)的治療方法如軟骨下鉆孔術(shù)、微骨折、自體骨軟骨鑲嵌成型術(shù)

3、和自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)等難以實(shí)現(xiàn)有效修復(fù)的的創(chuàng)傷軟骨組織。
　　 1．研究中選用膠原材料為主要原材料構(gòu)建組織工程支架。由于堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicFibroblastGrowthFactor，bFGF）是體內(nèi)最有效的有絲分裂原之一,對(duì)軟骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞有顯著的促有絲分裂作用。此外，bFGF還具有促進(jìn)未分化間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化、促血管增生作用。因此，選用bFGF為模型生長(zhǎng)因子。研究中將載有bFGF的納米顆粒負(fù)載

4、于雙側(cè)致密程度不同的膠原膜材料之間，進(jìn)而獲得復(fù)合支架材料。并對(duì)材料進(jìn)行體外釋放行為、體外細(xì)胞培養(yǎng)以及關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的研究。具體研究?jī)?nèi)容包括：制備一種復(fù)合負(fù)載bFGF的殼聚糖-肝素(CS-Hep)納米粒子的雙層膠原基復(fù)合材料，雙層膠原膜分別采用冷凍干燥法和風(fēng)干法制備，分別命名為CFM和CAM，對(duì)其進(jìn)行掃描電鏡和紅外表征；采用流池法，考察復(fù)合材料在PBS和膠原酶溶液兩種不同釋放介質(zhì)中對(duì)模型蛋白HSA的釋放行為，同時(shí)應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察異硫

5、氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的HSA在PBS溶液中的釋放情況。
　　 2．體外培養(yǎng)L-929細(xì)胞，分別接種于復(fù)合bFGF雙層膠原基復(fù)合材料(bDM)和未復(fù)合bFGF雙層膠原基復(fù)合材料(DM)以及交聯(lián)的凍干膠原膜(CFM)表面，用四甲基偶氮唑鹽微量反應(yīng)比色法(MTT)法、激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在第3、5天的粘附和增殖的情況。
　　 3．制備bFGF/雙層膠原基復(fù)合材料浸提液，進(jìn)行急性全身毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)和細(xì)胞毒

6、性試驗(yàn)，對(duì)材料進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。
　　 4.選取60只家兔，隨機(jī)分成5組bDM-CFM（bDM材料CFM朝向軟骨下骨面）組、bDM-CAM（bDM材料CAM朝向軟骨下骨面）組、DM-CFM（DM材料CFM朝向軟骨下骨面）組、DM-CAM（DM材料CAM朝向軟骨下骨面）組、假手術(shù)對(duì)照（單純?nèi)睋p不加干預(yù)）組。于兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)構(gòu)建軟骨缺損模型，將材料分別按CFM和CAM層朝向軟骨下骨面植入缺損處，術(shù)后1、2、4、8、12、16周采集標(biāo)

7、本，通過大體觀察、組織學(xué)評(píng)分、免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原，分析不同處理組軟骨修復(fù)的情況。并在上述實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，于第3d、1w、2w、4w、8w分別抽取關(guān)節(jié)液，用抗體芯片檢測(cè)20種相關(guān)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及炎性趨化因子的時(shí)間變化情況。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，bFGF/雙層膠原基復(fù)合材料兩側(cè)疏松程度差異明顯。在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，釋放液為PBS時(shí)，CAM→CFM釋放百分率高；而在膠原酶釋放液中，CFM→CAM組釋放百分率高，F(xiàn)ITC標(biāo)記的HSA釋放

8、實(shí)驗(yàn)顯示雙層材料對(duì)于蛋白分子具有不均一的釋放特點(diǎn)。這些結(jié)果提示，所構(gòu)建的支架材料對(duì)生長(zhǎng)因子具有時(shí)空控制性釋放特點(diǎn)。
　　 在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，所有材料均顯示良好的細(xì)胞粘附和促增殖作用，同時(shí)包載bFGF組細(xì)胞增殖率較相應(yīng)未包載bFGF組更高(P＜0.05)。包載bFGF材料由于結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致bDM-CFM層更有利于細(xì)胞粘附和增殖(P＜0.05），這可能與bDM-CFM對(duì)生長(zhǎng)因子有時(shí)空控制釋放特性有關(guān)；激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果也證

9、實(shí)了這一觀點(diǎn)。
　　 生物學(xué)評(píng)價(jià)研究發(fā)現(xiàn)，bFGF/雙層膠原基復(fù)合材料浸提液pH值為6.55±0.13，接近中性；急性全身毒性試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)均為陰性,細(xì)胞毒性為0級(jí)，說明本材料具有良好的生物安全性，對(duì)機(jī)體無(wú)毒，對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)的親和作用。
　　 關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)過程中，對(duì)不同時(shí)期關(guān)節(jié)液中生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及炎性趨化因子進(jìn)行抗體芯片檢測(cè)，結(jié)果表明因材料結(jié)構(gòu)不同而引起的生長(zhǎng)因子釋放不同可導(dǎo)致被檢因子表現(xiàn)出不同的時(shí)間變化過程