七氟醚對(duì)老年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響及其與Egr1、CREB表達(dá)與激活的關(guān)系.pdf

1、術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是手術(shù)麻醉后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量，增加了家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。老年人的大腦發(fā)生了廣泛的結(jié)構(gòu)和生理性改變，與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)樹突棘形態(tài)改變、細(xì)胞間連接以及鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、基因表達(dá)改變。這些因素導(dǎo)致老年腦的突觸可塑性改變，進(jìn)而對(duì)各種全身麻醉藥的敏感性增加。Moller等研究發(fā)現(xiàn)60歲以上人群POCD發(fā)生率在1周內(nèi)為25.8％

2、，3個(gè)月時(shí)為9.9％。POCD的發(fā)病機(jī)理尚不清楚，但基本確定老年是術(shù)后長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素。近年來(lái)，七氟醚在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。但有研究表明七氟醚可導(dǎo)致凋亡，增加beta-amyloid protein levels(Aβ)的水平，并可通過(guò)活化特定激酶增加tau蛋白磷酸化并可引起空間記憶缺陷。在長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-termpotentiation，LTP)早期合成的絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen-act

3、ivated protein kinases/ extracellular regulated proteinkinases，MAPK/ERK)通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP responseelement binding protein，CREB)磷酸化而促進(jìn)早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1(earlygrowth response factor1，Egr1)的合成，從而形成和鞏固晚期長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)。這一通路在長(zhǎng)時(shí)程記憶形成和鞏

4、固過(guò)程中起重要作用。因此，這一通路可能參與七氟醚致認(rèn)知功能減退過(guò)程并起重要作用，本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述。
　　第1部分 老年小鼠海馬內(nèi)pCREB和Egr1的表達(dá)與鞏固的空間記憶的提取有關(guān)
　　目的：
　　研究老年小鼠海馬內(nèi)磷酸化環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(phosphorylationof the cAMP response element binding protein，pCREB)和早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1(earl

5、y growth response factor1，Egr1)表達(dá)與鞏固的水迷宮空間記憶的提取之間的關(guān)系。
　　方法：
　　選擇18月齡雄性C57/BL6小鼠24只，隨機(jī)分為4個(gè)組，①不進(jìn)行訓(xùn)練也不進(jìn)行空間探索試驗(yàn)組（空白組）;②不進(jìn)行訓(xùn)練但進(jìn)行同樣的空間探索試驗(yàn)（NTPRT組）;③進(jìn)行訓(xùn)練并進(jìn)行空間探索試驗(yàn)（PRT組）;④進(jìn)行訓(xùn)練但不進(jìn)行空間探索試驗(yàn)（NPRT組）。水迷宮訓(xùn)練過(guò)程包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩個(gè)部分。首先

6、進(jìn)行3天適應(yīng)訓(xùn)練，主要包括適應(yīng)水溫和周圍環(huán)境。定位航行試驗(yàn)(place navigation test)歷時(shí)14天，小鼠尋找平臺(tái)的最大時(shí)限設(shè)定為60秒，小鼠在平臺(tái)停留60秒，以提供時(shí)間讓小鼠觀察周圍提示物，然后開始下一次訓(xùn)練?？臻g探索試驗(yàn)分別在第4天、第7天、第11天和第14天進(jìn)行。系統(tǒng)自動(dòng)分析包括逃避潛伏期、平臺(tái)象限游泳時(shí)間與總時(shí)間之比等參數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中主要用于比較的是空間探索實(shí)驗(yàn)中平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比。在空間探索試驗(yàn)中平臺(tái)

7、象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比超過(guò)30％認(rèn)為小鼠對(duì)提示物和平臺(tái)空間位置關(guān)系形成記憶。NTPRT組和PRT組在第15天再次進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，而空白組和NPRT組不接受空間探索試驗(yàn)。四組小鼠于空間探索試驗(yàn)結(jié)束后15min水合氯醛深度麻醉，經(jīng)左心進(jìn)行灌流后剝離腦組織，通過(guò)免疫熒光的方法檢測(cè)位置回想測(cè)試是否會(huì)引起Egr1和pCREB在海馬CA1和CA3區(qū)內(nèi)表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.水迷宮行為學(xué)結(jié)果
　　通過(guò)為期14天的水迷宮訓(xùn)練

8、，NPRT組和PRT組小鼠對(duì)平臺(tái)位置都形成了良好的空間鞏固記憶，從第1天到第14天小鼠逐漸學(xué)會(huì)了平臺(tái)的位置，這一點(diǎn)可以從逐漸縮短的逃逸潛伏期（從第1天到第13天）和空間探索試驗(yàn)中逐漸增加的平臺(tái)象限時(shí)間百分比（從第4天到第14天）得出，從第1天到第14天的訓(xùn)練的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，逃逸潛伏期顯著下降（F9，126=22.08，p＜0.0001），最主要的效應(yīng)在第12天(F=152.41，p＜0.0001);從第4天到第14天的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析顯示平

9、臺(tái)象限的時(shí)間百分比顯著增加(F3，39=11.32，p＜0.0001)，達(dá)到漸進(jìn)水平是在第11天。在第4天，第7天，第11天，第14天通過(guò)空間探索試驗(yàn)對(duì)平臺(tái)位置的記憶進(jìn)行評(píng)估。目標(biāo)象限的時(shí)間百分比與對(duì)立象限的時(shí)間百分比進(jìn)行比較，后者比前者顯著下降(t=229.448，p＜0.0001)，說(shuō)明對(duì)平臺(tái)已形成記憶。第14天，PRT組和NPRT組小鼠之間的表現(xiàn)沒(méi)有差別(t=0.075，p=0.789)。在整個(gè)訓(xùn)練過(guò)程中，沒(méi)有小鼠有趨觸行為和漂浮

10、行為，統(tǒng)計(jì)分析顯示訓(xùn)練過(guò)程中各組小鼠的游泳速度沒(méi)有顯著性差別(F＜1，p＞0.3)。
　　2.免疫組化結(jié)果
　　第15天在最后一次空間探索試驗(yàn)后15分鐘所有小鼠處死取腦，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，結(jié)果如下:①NPRT組和PRT組比較:pCREB在CA1區(qū)的表達(dá)NPRT組比PRT組顯著降低(p＜0.05);Egr1在CA1區(qū)的表達(dá)NPRT組比PRT組顯著降低(p＜0.05);pCREB在CA3區(qū)的表達(dá)NPRT組比PRT組顯著降低(p＜

11、0.05);Egr1在CA3區(qū)的表達(dá)NPRT組比PRT組顯著降低(p＜0.05)。②NPRT組、PRT組與NTPRT組、空白組比較:pCREB在CA1區(qū)的表達(dá)NPRT組和PRT組比空白組和NTPRT組顯著升高(p＜0.05);Egr1在CA1區(qū)的表達(dá)NPRT組和PRT組比空白組和NTPRT組顯著升高(p＜0.05);pCREB在CA3區(qū)的表達(dá)NPRT組和PRT組比空白組和NTPRT組顯著升高(p＜0.05);Egr1在CA3區(qū)的表達(dá)NP

12、RT組和PRT組比空白組和NTPRT組顯著升高(p＜0.05)。③NTPRT組和空白組比較:pCREB在CA1區(qū)的表達(dá)NTPRT組和空白組比較，兩組之間無(wú)顯著性差異(p＞0.05);pCREB在CA3區(qū)的表達(dá)NTPRT組和空白組比較，兩組之間無(wú)顯著性差異(p＞0.05);Egr1在CA1區(qū)的表達(dá)NTPRT組和空白組比較，兩組之間無(wú)顯著性差異(p＞0.05);Egr1在CA3區(qū)的表達(dá)NTPRT組和空白組比較，兩組之間無(wú)顯著性差異(p＞0.

13、05)。④海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)比較:所有組別中pCREB在CA3區(qū)的表達(dá)量顯著高于CA1區(qū)(p＜0.05);所有組別中Egr1在CA1區(qū)的表達(dá)量顯著高于CA3區(qū)(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　?、僭谒詫m訓(xùn)練中，空間記憶鞏固后進(jìn)行提取與老年小鼠海馬內(nèi)pCREB和Egr1的表達(dá)相關(guān);
　?、诶夏晷∈蠛ｑR內(nèi)pCREB在CA3區(qū)的表達(dá)量明顯高于CA1區(qū)，而Egr1在CA1區(qū)的表達(dá)量明顯高于CA3區(qū)。
　　第2部分

14、七氟醚麻醉后老年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶缺陷與海馬內(nèi)pCREB和Egr1表達(dá)的下調(diào)有關(guān)
　　目的：
　　麻醉藥物與術(shù)后認(rèn)知功能障礙的關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)，但具體的機(jī)理還不清楚，而海馬內(nèi)pCREB和Egr1對(duì)晚期長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)或長(zhǎng)時(shí)記憶的形成至關(guān)重要，為了更好地了解吸入麻醉藥對(duì)中樞神經(jīng)的影響，我們研究老年小鼠七氟醚麻醉4h后的行為學(xué)改變以及海馬內(nèi)pCREB和Egr1表達(dá)的變化。
　　方法：
　　18月齡老年小鼠隨機(jī)分入麻醉組和

15、對(duì)照組，麻醉組小鼠3％七氟醚麻醉4h，而對(duì)照組吸入100％的氧氣4小時(shí)，水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)量在麻醉后48小時(shí)進(jìn)行，定位航行試驗(yàn)為期6天，定位航行試驗(yàn)結(jié)束后即刻進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)束后15min，兩組小鼠深度麻醉后同時(shí)斷頭取腦，快速分離腦組織取海馬，通過(guò)western blot和RT-PCR方法檢測(cè)兩組小鼠海馬內(nèi)Egr1和pCREB表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1、水迷宮行為學(xué)結(jié)果
　　通過(guò)為期6天的定位航行

16、訓(xùn)練，對(duì)照組在第4、5和第6天比麻醉組能更快找到平臺(tái)，差別有顯著性（所有p＜0.05）;在空間探索試驗(yàn)中，對(duì)照組平臺(tái)象限時(shí)間百分比顯著高于麻醉組(p＜0.01)。
　　2、免疫印跡結(jié)果
　　①麻醉組小鼠海馬內(nèi)pCREB的表達(dá)量顯著下降(p＜0.01);②麻醉組小鼠海馬內(nèi)Egr1的表達(dá)量顯著下降(p＜0.05)。
　　3、RT-PCR結(jié)果
　?、賰山M小鼠海馬內(nèi)CREB mRNA表達(dá)量之間沒(méi)有顯著差異(p＞0.05)