自體臍帶血血清培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的初步研究.pdf

1、目的：初步探討自體臍帶血血清（humanumbilicalcordbloodserum，hCBS）培養(yǎng)對(duì)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（humanamnioticmesenchymalstemcells，hAMSCs）增殖、表面分子和某些特征性蛋白表達(dá)的影響，為hAMSCs用于細(xì)胞治療提供優(yōu)化的培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。方法：采用胰蛋白酶-膠原酶分離法分離hAMSCs，運(yùn)用差速貼壁和傳代培養(yǎng)純化hAMSCs，制各自體hCBS，用10％hCBS加LG-DME

2、M培養(yǎng)基培養(yǎng)hAMSCs，觀察原代和傳至1-3代培養(yǎng)的hAMSCs生長(zhǎng)情況；流式細(xì)胞儀分析hAMSCs的表型和細(xì)胞周期；臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，繪制hAMSCs生長(zhǎng)曲線；RTreal-timePCR檢測(cè)波形蛋白、CK18、Alb、AFP、Oct-4和NanogmRNA表達(dá)，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；免疫細(xì)胞化學(xué)觀察波形蛋白、CK18、Alb的蛋白表達(dá)。結(jié)果：hCBS原代培養(yǎng)hAMSCs，48h貼壁，hAMSCs培養(yǎng)5d，細(xì)胞融合達(dá)80

3、％以上。hAMSCs傳代培養(yǎng)，24h內(nèi)貼壁，每3d換液1次，傳代的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S型，于第3-6d處于指數(shù)生長(zhǎng)期，平均倍增時(shí)間為32h。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，第3代hAMSCs的細(xì)胞周期主要集中于G0-G1期，細(xì)胞增殖指數(shù)為（24.8±4.3）％。第1至第3代hAMSCs均表達(dá)CD44+、CD29+、CD73+和CD166+，而基本不表達(dá)CD34和CD45；與第1代比，第2-3代hAMSCs表達(dá)CD44+、CD29+細(xì)胞數(shù)有增加趨勢(shì)。RT

4、real-timePCR檢測(cè)顯示，第3代hAMSCs高表達(dá)波形蛋白和AFPmRNA，低表達(dá)Alb、CK18mRNA，同時(shí)還有Oct-4和NanogmRNA的表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色和蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察顯示，第3代hAMSCs純度較高，高表達(dá)波形蛋白，低表達(dá)Alb和CK18蛋白。結(jié)論：新建立的hCBS培養(yǎng)體系由LG-DMEM和10％hCBS組成，可用于hAMSCs的培養(yǎng)，能較好地保持hAMSCs的增殖能力，維持其干細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的