4-1BBL-4-1BB共刺激信號對過敏性支氣管哮喘中Th17-Treg細胞平衡的調控研究.pdf

1、目的：
　　 本研究欲探討4-1BBL在過敏性支氣管哮喘的表達特征及其在過敏性哮喘發(fā)病中的作用，4-1BB抗體干預對Th17/Treg細胞功能失衡的調節(jié)。進一步明確哮喘的免疫學發(fā)病機制以及4-1BBL/4-1BB共刺激分子在哮喘中的作用機制，為尋求哮喘的免疫學治療提供新思路。
　　 方法：
　　 （一）人體研究
　　 我們使用ELISA方法檢測了過敏性哮喘患者和健康對照組血漿中可溶性4-1BBL（solu

2、ble 4-1BBL：s4-1BBL）的濃度，流式細胞術分析了過敏性哮喘患者和健康對照組單核細胞膜表面表達4-1BBL（m4-1BBL）的比例；利用real-time PCR技術相對定量的分析了哮喘患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells：PBMC）4-1BBL mRNA的表達情況。分離過敏性哮喘患者PBMC，體外加激動性4-1BB單抗或不加激動性4-1BB單抗，特異性刺激72小時收集細

3、胞和上清液，ELISA方法檢測細胞上清液中IL-17A、TGF-β的濃度，流式細胞術檢測刺激后Th17、Treg（regulatory T cells：Treg）細胞的比例。
　　 （二）動物模型研究
　　 SPF級BALB/c小鼠隨機分為哮喘組、4-1BB干預組和陰性對照組，每組6-10只，哮喘組小鼠于D0、D7、D14腹腔注射卵清蛋白（OVA）與佐劑氫氧化鋁(AL(OH)3)致敏，于D27、D28、D29 OVA滴鼻

4、激發(fā)構建哮喘模型，4-1BB干預組于D0天致敏后立即腹腔注射激動性4-1BB單抗，其余處理同哮喘組，陰性對照組所有處理由PBS代替。所有動物在第30天處死，眼球取血ELISA法檢測血清IgE，HE染色觀察各組呼吸道炎性反應，支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid：BALF）細胞計數(shù)與分類計數(shù)，ELISA檢測BALF中細胞因子IL-17A、TGF-β，蛋白免疫印跡法（western blotting）比

5、較哮喘組與陰性對照組4-1BBL的表達，流式細胞術分析肺組織Th17細胞、Treg細胞比例，real-time PCR相對定量小鼠肺組織炎癥部位RORγt mRNA與Foxp3 mRNA的表達。
　　 結果：
　　 1．哮喘患者外周血s4-1BBL與單核細胞表達4-1BBL較對照組均顯著下降，但PBMC中4-1BBL mRNA的表達無明顯下降；同時哮喘小鼠肺組織炎癥部位的4-1BBL蛋白明顯下降。
　　 2．哮喘

6、患者PBMC體外刺激72小時后，4-1BB抗體干預組較同型對照組，細胞上清液中IL-17濃度下降而TGF-β濃度升高，但兩組Th17、Treg細胞數(shù)無差異性。
　　 3．建立哮喘小鼠模型，哮喘組小鼠可見支氣管肺泡周圍有大量的炎癥浸潤，血清IgE濃度升高，BALF中細胞總數(shù)與嗜酸性粒細胞數(shù)顯著增加，而激動型4-1BB抗體干預組與哮喘組比較，小鼠支氣管肺泡炎癥細胞浸潤顯著減少，血清IgE濃度下降，且BALF中細胞總數(shù)與嗜酸性粒細胞均

7、顯著減小。
　　 4．哮喘組小鼠BALF中細胞因子IL-17濃度升高，TGF-β濃度降低；哮喘組小鼠肺組織炎癥部位Th17細胞數(shù)及其特異性轉錄因子RORγt mRNA表達顯著增加，而Treg細胞數(shù)與對照組比較無差異性，但Foxp3 mRNA顯著下降。
　　 5．4-1BB激動型抗體體內干預小鼠能抑制哮喘小鼠BALF中IL-17濃度的升高而促進TGF-β的分泌，且能抑制哮喘小鼠肺組織炎癥部位Th17細胞與RORγt mRN

8、A的表達；其雖不能增加哮喘小鼠肺組織中Treg細胞的數(shù)量，但能促進Treg細胞發(fā)揮功能所依賴的細胞因子Foxp3 mRNA的表達增加。
　　 結論：
　　 1．哮喘患者外周血以及哮喘小鼠肺組織的氣道炎癥部位4-1BBL的表達減少，這說明4-1BBL/4-1BB提供的共刺激信號的減少參與了哮喘的免疫學發(fā)病機制。
　　 2．哮喘小鼠的氣道炎癥部位存在Th17/Treg細胞功能的失衡，這種失衡可能與4-1BBL/4-1