HCV NS3-4A絲氨酸蛋白酶表達(dá)細(xì)胞系和重組細(xì)胞凋亡酶-3的構(gòu)建及其應(yīng)用的研究.pdf

1、丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的傳染性疾病，是慢性肝病的主要原因之一。全球范圍內(nèi)HCV感染人數(shù)達(dá)1.7億，我國(guó)約4000多萬(wàn)人，HCV感染已成為嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。迄今尚無(wú)疫苗和特異有效的治療藥物。 鑒于蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑在治療HIV方面取得良好療效，以蛋白酶和RNA聚合酶為靶標(biāo)尋找特異有效的治療藥物已成為HCV感染防治研究的重要方向之一。缺乏可靠的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，極大地阻礙了抗HCV藥物的篩選

2、，因此以酶分子為靶位的測(cè)定系統(tǒng)常作為藥物篩選的替代系統(tǒng)。由于候選藥物分子必須具有易進(jìn)入細(xì)胞、穩(wěn)定性好等特征，建立一種細(xì)胞水平上酶活性的測(cè)定系統(tǒng)對(duì)于篩選抗HCV藥物無(wú)疑有著重要意義。 NS3/4A絲氨酸蛋白酶在多聚蛋白前體加工成熟中起著關(guān)鍵的作用，是抗HCV的主要靶標(biāo)。鑒于NS3/4A絲氨酸蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)、生化特性和切割水解底物的特征，以及細(xì)胞凋亡酶3(caspase-3，簡(jiǎn)寫(xiě)為Casp3)的結(jié)構(gòu)特征和活化方式已經(jīng)明確。本研究依據(jù)

3、Casp3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重要的凋亡執(zhí)行分子之一，它的活化必然會(huì)引起細(xì)胞的凋亡。將Casp3中的特異切割位點(diǎn)轉(zhuǎn)換為HCVNS3/4A絲氨酸蛋白酶識(shí)別的特異序列，這種改構(gòu)的Casp3(rCasp3)進(jìn)入表達(dá)NS3/4A蛋白酶的細(xì)胞內(nèi)可以特異的被切割與活化，從而引起該細(xì)胞的凋亡。以細(xì)胞凋亡及其引起的活細(xì)胞數(shù)量減少等為指標(biāo)，間接反映NS3/4A蛋白酶的活性，初步建立以MTT為基礎(chǔ)的細(xì)胞內(nèi)NS3/4A蛋白酶活性測(cè)定系統(tǒng)。本研究分以下四個(gè)部分，主

4、要研究結(jié)果如下： 1.表達(dá)NS3/4A絲氨酸蛋白酶細(xì)胞系的建立從HCV感染患者血清中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增了含有部分NS4A核心區(qū)(21～34aa)與NS3N末端180aa的編碼基因，兩者通過(guò)Linker(GRRP)連接，記為NS3/4A；同時(shí)以NS3絲氨酸蛋白酶活性缺失突變體為陰性對(duì)照。構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pRSETA-NS3/4A及真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NS3/4A、pcDNA3.1-△NS3

5、/4A。將pRSETA-NS3/4A轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，并用親和層析法進(jìn)行純化獲得NS3/4A蛋白。將上述兩個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，通過(guò)G418(400μg/ml)壓力選擇，建立了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆，分別記為scpHepG2和△scpHepG2。將基因NS3/4A亞克隆入四環(huán)素反應(yīng)性質(zhì)粒pTRE2hyg，構(gòu)建了pTRE2hyg-NS3/4A；用四環(huán)素調(diào)控性質(zhì)粒pTRE-tet-on轉(zhuǎn)染HepG2

6、細(xì)胞，篩選出低背景高表達(dá)的Tet-onHepG2穩(wěn)定細(xì)胞系，進(jìn)而將pTRE2hyg-NS3/4A轉(zhuǎn)染該細(xì)胞，通過(guò)潮霉素(200μg/ml)壓力選擇獲得了誘導(dǎo)表達(dá)NS3/4A絲氨酸蛋白酶的雙穩(wěn)定細(xì)胞系，記為T(mén)-NS3/4AHepG2。 2.重組細(xì)胞凋亡酶-3的構(gòu)建與表達(dá)從Jurkat細(xì)胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作模板，PCR擴(kuò)增Casp3基因；通過(guò)重疊PCR方法，將Casp3序列中的切割位點(diǎn)轉(zhuǎn)換為NS3/4A絲氨酸蛋白酶切割

7、序列(NS4A/4B及NS5A/5B連接處)，記為rCasp3；構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-rCasp3與原核表達(dá)質(zhì)粒(含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域PTD)pETPTD-rCasp3；將pETPTD-rCasp3轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，并利用親和層析法得到純化PTD-rCasp3。 3.rCasp3的活化依賴(lài)NS3/4A蛋白酶活性的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)利用脂質(zhì)體法，將pcDNA3.1-rCasp3轉(zhuǎn)染scpHepG2和△

8、scpHepG2細(xì)胞。透射電鏡結(jié)果顯示：表達(dá)NS3/4A絲氨酸蛋白酶的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而沒(méi)有表達(dá)NS3/4A絲氨酸蛋白酶或其活性缺失的細(xì)胞沒(méi)有凋亡。用AnnexinV-PI雙染進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明：表達(dá)NS3/4A絲氨酸蛋白酶的HepG2細(xì)胞組凋亡率約45％，而表達(dá)NS3/4A絲氨酸蛋白酶或其活性缺失的細(xì)胞組凋亡率很低。臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞存活情況表明轉(zhuǎn)染NS3/4A絲氨酸蛋白酶的HepG2細(xì)胞組細(xì)胞存活率明顯低于

9、正常及陰性對(duì)照組。以上結(jié)果說(shuō)明，rCasp3的活化是依賴(lài)于NS3/4A絲氨酸蛋白酶的活性，并能夠引起細(xì)胞凋亡。 4.以MTT為基礎(chǔ)細(xì)胞內(nèi)NS3/4A活性測(cè)定系統(tǒng)的建立在上述基礎(chǔ)上，以pcDNA3.1-rCasp3轉(zhuǎn)染scpHepG2細(xì)胞或PTD-rCasp3與scpHepG2細(xì)胞共同孵育兩種方式，建立了以MTT為基礎(chǔ)的NS3/4A活性測(cè)定系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)顯示，無(wú)論以何種方式將rCasp3導(dǎo)入scpHepG2細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)都明顯降低；但

10、兩種導(dǎo)入方式，達(dá)到最大效應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)不同，轉(zhuǎn)染法72hOD值達(dá)到最低，而轉(zhuǎn)導(dǎo)法是16h；抑制劑預(yù)處理scpHepG2細(xì)胞組與正常細(xì)胞組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)無(wú)顯著性差異。因此，NS3/4A絲氨酸蛋白酶的活性能夠間接被細(xì)胞凋亡酶-3的活性所指示。 綜上所述，本研究構(gòu)建并獲得了兩種表達(dá)(組成性與可調(diào)控)NS3/4A絲氨酸蛋白酶的細(xì)胞系；構(gòu)建了NS3/4A活性特異性識(shí)別底物rCasp3(其切割位點(diǎn)用NS3/4A識(shí)別序列替換)；一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了活