膽堿能受體途徑在HaCaT細(xì)胞粘附及天皰瘡發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、天皰瘡是一種以血清中存在抗表皮蛋白抗體為特征的自身免疫性皮膚病，橋粒芯蛋白抗體在本病的發(fā)生中具有重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，除了橋粒芯蛋白途徑之外，還有其它因素在該病發(fā)生中發(fā)揮一定作用，其中膽堿能受體與天皰瘡關(guān)系較為密切。
　　本研究將以膽堿能受體為研究對象，利用HaCaT細(xì)胞構(gòu)建天皰瘡細(xì)胞模型，研究膽堿能受體途徑在細(xì)胞粘附和天皰瘡發(fā)病中的作用，從而進(jìn)一步完善天皰瘡的發(fā)病機(jī)制理論。
　　第1部分膽堿能途徑藥物對HaCaT細(xì)胞粘

2、附功能的影響及機(jī)制研究
　　目的:研究膽堿能途徑藥物對HaCaT細(xì)胞粘附功能的影響及其機(jī)制。
　　方法:培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞至融合狀態(tài)后，分別加入適當(dāng)濃度的膽堿能途徑藥物，通過細(xì)胞解離實驗檢測細(xì)胞粘附的變化情況，結(jié)果以細(xì)胞碎片數(shù)表示;分別用RIPA和TritonⅩ-100裂解細(xì)胞，得到總蛋白和胞漿蛋白，用Western Blot測定細(xì)胞表面與粘附相關(guān)的蛋白Dsg1、Dsg3、PG、E-鈣粘素的變化;用qPCR檢測上述細(xì)胞表面蛋

3、白在mRNA水平的變化。
　　結(jié)果:對照組、阿托品、筒箭毒堿、卡巴膽堿作用后細(xì)胞碎片數(shù)目分別為6.33±1.15、35.00±2.65、6.33±1.53、6.00±1.00;阿托品在蛋白質(zhì)和mRNA水平減少Dsg3表達(dá)，并使Dsg3從胞膜脫離，卡巴膽堿可增加Dsg1、Dsg3、PG表達(dá)，并促使Dsg1、PG粘附于胞膜。筒箭毒堿對各種細(xì)胞表面蛋白均無明顯影響。
　　結(jié)論:膽堿能途徑藥物可以調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附分子，尤其是橋粒分子的

4、表達(dá)，并影響這些分子在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性，從而介導(dǎo)細(xì)胞間粘附。
　　第2部分利用HaCaT細(xì)胞構(gòu)建天皰瘡細(xì)胞模型
　　目的:利用HaCaT細(xì)胞與PV-IgG共培養(yǎng)構(gòu)建天皰瘡細(xì)胞模型。
　　方法:收集典型尋常型天皰瘡患者，從血清中純化IgG，以1mg/ml的濃度與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)，通過細(xì)胞解離實驗觀察PV-IgG對HaCaT細(xì)胞粘附功能的影響;通過免疫熒光觀察橋粒蛋白的染色模式;通過Western Blot觀察橋粒分子

5、蛋白質(zhì)水平的變化;通過qPCR觀察橋粒分子mRNA水平的變化;通過免疫共沉淀研究Dsg3與PG的相互作用情況;通過磷酸化測定觀察p38 MAPK、EGFR磷酸化水平。
　　結(jié)果: PV-IgG與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)后，可以使HaCaT細(xì)胞碎片數(shù)目增多，橋粒分子內(nèi)化降解，橋粒穩(wěn)定性下降，Dsg3與PG相互作用減弱，但對橋粒分子mRNA水平的表達(dá)沒有影響;也可出現(xiàn)p38MAPK與EGFR的磷酸化，且p38 MAPK的磷酸化發(fā)生于EGF

6、R磷酸化之前。
　　結(jié)論:利用HaCaT細(xì)胞和PV-IgG可以構(gòu)建天皰瘡的細(xì)胞模型，橋粒分子出現(xiàn)了與體內(nèi)棘層松解過程一致的變化。
　　第3部分膽堿能受體激動劑卡巴膽堿緩解天皰瘡棘層松解的機(jī)制研究
　　目的:研究膽堿能受體激動劑對天皰瘡棘層松解的緩解作用及其機(jī)制。 方法:將HaCaT細(xì)胞與PV-IgG和膽堿能受體激動劑卡巴膽堿共培養(yǎng)，以PV-IgG誘導(dǎo)的天皰瘡細(xì)胞模型作為對照，通過細(xì)胞解離實驗定量分析卡巴膽堿對棘

7、層松解的緩解情況，用免疫熒光方法定性觀察橋粒蛋白變化;分別用RIPA和TritonⅩ-100裂解細(xì)胞，得到總蛋白和胞漿蛋白，用Western Blot觀察細(xì)胞表面與粘附相關(guān)的Dsg3、PG的變化，以及不同時間點p38 MAPK、EGFR的磷酸化水平;用qPCR檢測上述細(xì)胞表面蛋白在mRNA水平的變化;通過免疫共沉淀方法定性分析Dsg3與PG相互作用的變化情況。
　　結(jié)果:在HaCaT細(xì)胞與PV-IgG、卡巴膽堿共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與PV-

8、IgG組相比細(xì)胞碎片數(shù)明顯減少（18.67±2.52 vs46.67±2.03，t=11.22，p＜0.01）;免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)卡巴膽堿可以緩解PV-IgG所致的橋粒分子內(nèi)化。在天皰瘡細(xì)胞模型中，細(xì)胞總的Dsg3和PG含量下降，非橋粒部分的Dsg3下降，非橋粒PG含量增加，且Dsg3與PG的相互作用減弱，加入卡巴膽堿后可緩解上述變化?？ò湍憠A也可使Dsg3 mRNA的相對表達(dá)量由1.428±0.215增加至4.974±0.948（t=3

9、.65，p=0.01），PG mRNA的相對表達(dá)量由1.563±0.247增加至13.420±1.715（t=6.85，p＜0.01）。磷酸化實驗中，卡巴膽堿可以抑制EGFR磷酸化，而對p38 MAPK磷酸化無明顯影響。
　　結(jié)論:膽堿能受體激動劑卡巴膽堿具有緩解棘層松解的作用，這種緩解作用的機(jī)制可能包括:抑制Dsg3和PG內(nèi)化并增加其表達(dá)，增強(qiáng)Dsg3與PG的相互作用，抑制棘層松解關(guān)鍵信號EGFR的磷酸化。
　　第4部分干

10、擾m3、α9 AChR對HaCaT細(xì)胞粘附功能的影響
　　目的:研究m3、α9 AChR干擾后HaCaT細(xì)胞粘附功能和橋粒分子的變化情況。
　　方法:利用RNA干擾技術(shù)分別干擾m3、α9 AChR的表達(dá)，檢測干擾效率及最佳的干擾時間;利用細(xì)胞解離實驗觀察m3或α9 AChR表達(dá)抑制后HaCaT粘附功能的變化情況;利用Western Blot觀察m3或α9 AChR表達(dá)抑制后骨架相關(guān)和非骨架相關(guān)橋粒連接蛋白的變化;利用qPCR

11、觀察橋粒蛋白mRNA水平的變化。
　　結(jié)果:在HaCaT細(xì)胞中加入m3或α9 AChR干擾序列后，在48h對相應(yīng)基因的表達(dá)均有較好的抑制效果;m3 AChR表達(dá)抑制后細(xì)胞粘附力下降而α9 AChR的低表達(dá)對細(xì)胞粘附功能沒有明顯影響;m3 AChR表達(dá)抑制后使橋粒穩(wěn)定性下降，α9 AChR表達(dá)抑制使橋粒穩(wěn)定性提高;m3 AChR表達(dá)抑制后，Dsg1 mRNA表達(dá)水平下降、PG表達(dá)增多，α9 AChR表達(dá)抑制后，Dsg1、PG mRN

12、A的表達(dá)增多，Dsg3表達(dá)下降。
　　結(jié)論:干擾m3 AChR的表達(dá)后HaCaT細(xì)胞的粘附力下降，橋粒穩(wěn)定性下降;干擾α9 AChR并不影響細(xì)胞粘附功能，但可使橋粒穩(wěn)定性上升。
　　第5部分干擾m3、α9 AChR對天皰瘡細(xì)胞模型棘層松解的影響
　　目的:探索m3或α9 AChR低表達(dá)時HaCaT細(xì)胞在PV-IgG作用下棘層松解的變化情況。
　　方法:通過RNA干擾技術(shù)抑制HaCaT細(xì)胞m3或α9 AChR的表達(dá)

13、，在此基礎(chǔ)上與PV-IgG共培養(yǎng)，通過細(xì)胞解離實驗觀察細(xì)胞粘附功能的變化;通過免疫熒光觀察橋粒分子染色模式的變化;利用Western Blot觀察m3或α9 AChR表達(dá)抑制后骨架相關(guān)和非骨架相關(guān)橋粒連接蛋白的變化;通過免疫共沉淀研究Dsg3與PG的相互作用情況;通過磷酸化測定觀察p38 MAPK、EGFR磷酸化水平。
　　結(jié)果:在m3 AChR干擾時，HaCaT在PV-IgG作用下更容易發(fā)生棘層松解，骨架相關(guān)的Dsg3和PG明顯